1、1,發(fā)酵動力學(xué)研究的內(nèi)容 研究發(fā)酵動力學(xué)的方法 發(fā)酵動力學(xué)研究步驟 發(fā)酵動力學(xué)研究的意義 發(fā)酵動力學(xué)模型 發(fā)酵動力學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),發(fā)酵動力學(xué)實(shí)驗(yàn),2,發(fā)酵動力學(xué)是研究各種發(fā)酵過程變量在活細(xì)胞作用下的變化規(guī)律，以及各種發(fā)酵條件對這些變量變化速度的影響。 以化學(xué)熱力學(xué)（研究反應(yīng)的方向）和化學(xué)動力學(xué)（研究反應(yīng)的速度）為基礎(chǔ)，對發(fā)酵過程中各種物質(zhì)的變化進(jìn)行描述。,一、發(fā)酵動力學(xué)研究的內(nèi)容,3,研究內(nèi)容,微生物生長動力學(xué),基質(zhì)消耗動力學(xué),產(chǎn)物生成動力學(xué),4,二、研究發(fā)酵動力學(xué)的方法,發(fā)酵動力學(xué)研究的前提,反應(yīng)器內(nèi)的攪拌系統(tǒng)能保證理想的混合； 溫度、pH等環(huán)境條件能夠控制以保持穩(wěn)定； 細(xì)胞有固有的化學(xué)組成，不

2、隨發(fā)酵時(shí)間和某些發(fā)酵條件的變化而發(fā)生明顯變化； 各種描述發(fā)酵動態(tài)的變量對發(fā)酵條件變化的反應(yīng)無明顯滯后。,5,1.宏觀處理法：把細(xì)胞看成一個(gè)均勻分布的物體，不管微觀反應(yīng)機(jī)制，只考慮各個(gè)宏觀變量之間的關(guān)系，這樣便得出結(jié)構(gòu)模型和非結(jié)構(gòu)模型 2.質(zhì)量平衡法：根據(jù)質(zhì)量守恒定律，對某一物質(zhì)在過程發(fā)生前后的質(zhì)量變化進(jìn)行恒算。,發(fā)酵動力學(xué)研究方法,6,質(zhì)量平衡式,物質(zhì)在系統(tǒng)中積累的速度= 物質(zhì)進(jìn)入系統(tǒng)的速度+物質(zhì)在系統(tǒng)中生成的速度-物質(zhì)排出系統(tǒng)的速度-物質(zhì)在系統(tǒng)中消耗的速度,某物質(zhì)在系統(tǒng)中的含量能夠在線測量或估計(jì)，通過建立上述平衡方程式，就可以確定該物質(zhì)在系統(tǒng)中變化的動力學(xué)。,人為加入或排出和通過相界面?zhèn)髻|(zhì)進(jìn)

3、入或排出,三、發(fā)酵動力學(xué)研究步驟,7,獲得發(fā)酵過程中能夠反映發(fā)酵過程變化的多種理化參數(shù),尋求發(fā)酵過程變化的多種理化參數(shù)與微生物發(fā)酵代謝規(guī)律之間的相互關(guān)系,建立多種數(shù)學(xué)模型，描述多種理化參數(shù)隨時(shí)間變化的關(guān)系,利用計(jì)算機(jī)和程序控制，反復(fù)驗(yàn)證多種數(shù)學(xué)模型的可行性的適用范圍,8,氧需求,好氧發(fā)酵,兼性好氧發(fā)酵,厭氧發(fā)酵,液體表面發(fā)酵,液體深層發(fā)酵,深層發(fā)酵,操作方法,分批發(fā)酵,分批補(bǔ)料發(fā)酵,連續(xù)發(fā)酵,微生物發(fā)酵動力學(xué)的研究與發(fā)酵的種類、方式密切相關(guān),四、發(fā)酵動力學(xué)研究的意義,通過對發(fā)酵反應(yīng)動力學(xué)的研究，進(jìn)行最佳發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件的控制。發(fā)酵過程中，菌體的濃度、基質(zhì)濃度、溫度、pH值、溶解氧等工藝參數(shù)的控

4、制方案，可以在這研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。,設(shè)計(jì)合理的發(fā)酵過程，也必須以發(fā)酵動力學(xué)模型作為依據(jù)，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行程序設(shè)計(jì)、模擬最合適的工藝流程和發(fā)酵工藝參數(shù)，從而使生產(chǎn)控制達(dá)到最優(yōu)化。,發(fā)酵動力學(xué)的研究還在為試驗(yàn)工廠比擬放大、為分批發(fā)酵過渡到連續(xù)發(fā)酵提供理論依據(jù)。,10,發(fā)酵過程中，基質(zhì)主要消耗在：滿足菌體生長消耗維持微生物生存的消耗合成代謝產(chǎn)物的消耗,S，基質(zhì)（底物）；G，菌體生長； M，維持代謝；P，產(chǎn)物合成,1、幾個(gè)基本概念,五、發(fā)酵動力學(xué)模型,11,1.維持因數(shù)(m) ：單位重量的（菌體）細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)用于維持代謝消耗的基質(zhì)的量。 一般來講指維持細(xì)胞最低活性所需消耗的能量。（碳，氮，氧等的

5、維持因數(shù)mc,mn,mo）,ms:以基質(zhì)消耗為基準(zhǔn) 的維持因數(shù)， X:菌體干重； S:基質(zhì)量 t:發(fā)酵時(shí)間； M:表示維持。,12,基質(zhì)的消耗速度,基質(zhì)的消耗比速率,2.比速（率）:單位時(shí)間內(nèi)，單位干菌體消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物（菌體）的量 (消耗的基質(zhì)用于維持代謝，菌體生長和產(chǎn)物合成)。比速率是生物反應(yīng)中用于描述反應(yīng)速度的常用概念,13,菌體的比生長速率,產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,14,3.生長得率：菌體的生長量相對于基質(zhì)消耗量的收得率。,YX/s: 相對與基質(zhì)消耗的實(shí)際生長得率系數(shù),Yg/s: 相對于基質(zhì)消耗的（純生長）理論得率系數(shù),特定的基質(zhì)及在特定環(huán)境條件下培養(yǎng)的特定微生物，它是一個(gè)常數(shù)，又稱最大生

6、長得率或生長得率常數(shù)。,15,4.產(chǎn)物得率：產(chǎn)物的合成相對于基質(zhì)消耗量的收得率。,YP/s: 相對于基質(zhì)消耗的實(shí)際產(chǎn)物得率系數(shù),Yps: 相對于基質(zhì)消耗的產(chǎn)物理論得率系數(shù),理論產(chǎn)物得率取決于產(chǎn)物的生物合成途徑，對于由特定基質(zhì)經(jīng)特定途徑產(chǎn)生的特定產(chǎn)物來說，它是一個(gè)常數(shù)，不因菌株和發(fā)酵條件的不同而異。,16,17,：菌體的生長比速 s：單一限制性基質(zhì)濃度 Ks：半飽和常數(shù) max: 最大比生長速率,s,1.Monod方程式,2、微生物生長動力學(xué),ks,莫諾方程成立的假設(shè)條件： 菌體生長為均衡型非結(jié)構(gòu)式生長，細(xì)胞成分只需要用一個(gè)參數(shù)即菌體濃度表示； 只有一種底物是生長限制性底物，并且沒有反饋抑制性產(chǎn)

7、物出現(xiàn)； 微生物生長沒有動態(tài)滯后性。,18,19,Monod方程中單一限制性基質(zhì)可以是培養(yǎng)基中任何一種與微生物生長有關(guān)的營養(yǎng)物，只要該基質(zhì)相對缺乏，就成為限制性生長因子。實(shí)際過程中，可能出現(xiàn)多種限制性基質(zhì)和抑制性物質(zhì)，影響了Monod方程的適用性。,20,Ks ，微生物對基質(zhì)的飽和常數(shù),當(dāng)= 1/2max，s= Ks 當(dāng)s Ks，基質(zhì)濃度較高時(shí)，與s無關(guān)，零級反應(yīng)。 當(dāng)s趨近于無窮大時(shí)，=max.max是理論上最大的生長潛力。,m,m/2,ks,s,21,米氏方程,m,m/2,ks,s,莫諾方程,22,莫諾方程與米氏方程 二者形式相同，但微生物生長是細(xì)胞群體生命活動的綜合表現(xiàn)，機(jī)理非常復(fù)雜。

8、Monod方程與米氏方程的區(qū)別與聯(lián)系是： Monod方程是對實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的總結(jié)，是經(jīng)驗(yàn)方程（empirical model）； 米氏方程是根據(jù)酶反應(yīng)機(jī)理推導(dǎo)得出，是機(jī)理方程（mechanistic model）。,由于微生物的代謝產(chǎn)物，特別是次級代謝產(chǎn)物的合成途徑特別復(fù)雜，其動力學(xué)過程不僅受菌體自身基因型的限制，還與其生活的外部條件有密切關(guān)系。目前整個(gè)動態(tài)變化過程的規(guī)律仍不是十分清楚，大多數(shù)研究只是限于宏觀變量的非結(jié)構(gòu)模型。,23,3、微生物的產(chǎn)物生成動力學(xué),24,根據(jù)細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進(jìn)行分類,Luedeking-Piret模型是一常見的分批發(fā)酵產(chǎn)物合成動力學(xué)模型，它把產(chǎn)物生成速率看作是

9、菌體生長速率和菌體濃度的函數(shù)，用數(shù)學(xué)式表示為：,式中：與生長偶聯(lián)的產(chǎn)物形成系數(shù) 非生長偶聯(lián)的相關(guān)系數(shù),25,偶聯(lián)型：產(chǎn)物生成速率與細(xì)胞生長速率有緊密聯(lián)系，合成的產(chǎn)物通常是分解代謝的直接產(chǎn)物，如葡萄糖厭氧發(fā)酵生成乙醇，或者好氣發(fā)酵生成中間代謝物(氨基酸或維生素)。這類初級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)速率與生長直接有關(guān)。式中0，0,混合型：生長與產(chǎn)物生成相關(guān)(如乳酸、檸檬酸、谷氨酸等的發(fā)酵)，發(fā)酵產(chǎn)物生成速率可由Luedeking-Piret模型數(shù)學(xué)式描述，式中0，0。 該混合型模型復(fù)雜的形成是將常數(shù)、作為變數(shù)，它們在分批發(fā)酵的四個(gè)時(shí)期分別具有特定的數(shù)值。,根據(jù)細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進(jìn)行分類,26,非生長偶

10、聯(lián)型：在生長和產(chǎn)物無關(guān)聯(lián)的發(fā)酵模式中，細(xì)胞生長時(shí)，無產(chǎn)物，但細(xì)胞停止生長后，則有大量產(chǎn)物積累，產(chǎn)物的形成速率只與細(xì)胞積累量有關(guān)。產(chǎn)物合成發(fā)生在細(xì)胞生長停止之后(即產(chǎn)生于次級生長)，故習(xí)慣上把這類與生長無關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物稱為次級代謝產(chǎn)物，但不是所有次級代謝產(chǎn)物一定是與生長無關(guān)聯(lián)的。大多數(shù)抗生素和微生物毒素的發(fā)酵都是非生長偶聯(lián)的例子，非偶聯(lián)型發(fā)酵的生產(chǎn)速率只與已有的菌體量有關(guān)，而比生產(chǎn)速率為一常數(shù)，與比生長速率沒有直接關(guān)系。因此，其產(chǎn)率和產(chǎn)物濃度高低取決于細(xì)胞生長期結(jié)束時(shí)的生物量。式中0，0,根據(jù)細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進(jìn)行分類,27,4、微生物的基質(zhì)消耗動力學(xué),假設(shè)發(fā)酵過程沒有中間代謝產(chǎn)物積累，則含

11、碳基質(zhì)的質(zhì)量平衡算式為： 消耗的含碳基質(zhì)=維持代謝消耗量+菌體生長消耗量+產(chǎn)物合成消耗量 即：,28,微分后：,式中：ms維持系數(shù)，即單位菌體、單位時(shí)間內(nèi)用 于菌體維持生命活動的基質(zhì)量,單純用于合成單位菌體所消耗的基質(zhì)量,單純用于合成單位產(chǎn)物所消耗的基質(zhì)量,上式反映了基質(zhì)消耗與菌體生長及產(chǎn)物生成之間的關(guān)系。因此，當(dāng)生長動力學(xué)模型和產(chǎn)物生成動力學(xué)模型確定后，基質(zhì)消耗動力學(xué)模型即可確定。,29,六、發(fā)酵動力學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),1.實(shí)驗(yàn)材料,菌種：雅致放射毛霉AS3.2778 培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基（參考實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)） 試劑：DNS試劑,2.實(shí)驗(yàn)步驟,菌種斜面培養(yǎng)：配制PDA培養(yǎng)基100ml

12、，分裝試管，滅菌后擺成斜面，將雅致放射毛霉接種于斜面上，25 培養(yǎng)48h。 種子培養(yǎng)：斜面菌種在25恒溫培養(yǎng)48h 后，轉(zhuǎn)接于500mL 搖瓶，裝液量為150 mL，160 r/min 25 ，搖床培養(yǎng)16h為種液。,30,發(fā)酵培養(yǎng): 5 L 發(fā)酵罐中裝入3.5 L 的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基在在121 下滅菌30 min，溫度降至30 時(shí)，接入種液，接種量為4%控制適宜的通氣比、保持罐壓為0.05 MPa、發(fā)酵溫度30 、攪拌速度160 r/min條件下發(fā)酵84h每12 h 取樣1 次進(jìn)行菌體生長量、還原糖產(chǎn)量、蔗糖糖消耗測定結(jié)果為3 次重復(fù)。,3.分析方法,菌體生物量的測定：采用比濁法，發(fā)酵液以

13、蒸餾水稀釋，5000 r/min 離心10 min，除去上清液，菌體沉淀用生理鹽水洗2-3次再離心去上清液，用生理鹽水重懸并進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測定其OD600nm。,31,還原糖的測定：（1）在堿性條件下，還原糖與3、5二硝基水楊酸共熱，3、5二硝基水楊酸被還原為3氨基5硝基水楊酸（棕紅色物質(zhì)），還原糖則被氧化成糖酸及其它物質(zhì)。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度呈一定的比例關(guān)系，可在722型分光光度計(jì)540nm波長測定棕紅色物質(zhì)的吸光度值。查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，可求出發(fā)酵液中還原糖的含量。,（2）取4支干燥試管,編號,按下表所示的量,精確加入待測液和試劑(ml):,32,加完試劑后, 將各管搖勻，戴上小漏斗，在沸水浴中加熱5分鐘，立即用冷水冷卻至室溫，再向各管中加入蒸餾水 20.0ml，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻。切勿用力振搖，引入氣