1、實(shí)驗(yàn)六 離子交換柱層析法分離氨基酸,目的要求 （1）學(xué)習(xí)采用離子交換樹(shù)脂分離氨基酸的基本原理。 （2）掌握離子交換柱層析法的基本操作技術(shù)。,一、原理,離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的層析方法。 即溶液中的離子同離子交換劑上功能基團(tuán)交換反應(yīng)的過(guò)程。,帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來(lái)。,離子交換過(guò)程示意： 起始 吸附 解吸 完成 x+ : 起始緩沖離子 y+ ：待分離離子 z+ ：待分離離子,二、離子交換劑的種類(lèi),在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即離子交換劑。 （一）

2、按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同 陽(yáng)離子交換劑 帶負(fù)電荷，與陽(yáng)離子交換 陰離子交換劑 帶正電荷，與陰離子交換,（二）按載體種類(lèi)不同 1.離子交換樹(shù)脂：主要有聚苯乙烯樹(shù)脂 苯乙烯+二乙烯苯 聚苯乙烯 （單體）（交聯(lián)劑） 二乙烯苯 交聯(lián)度 = 100% 苯乙烯 + 二乙烯苯,交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進(jìn)入樹(shù)脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。 在不影響分離的情況下，以采用交聯(lián)度較高的樹(shù)脂為好，這樣可以提高樹(shù)脂對(duì)離子的選擇性 。,目數(shù)：離子交換樹(shù)脂的顆粒直徑大小 Dowex 50 為20-50目 Dowex 20 840m 50 297m 100 149m （代表二乙烯苯的百分含量）,樹(shù)脂resin（據(jù)所

3、含交換基團(tuán)的性質(zhì)分） 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 強(qiáng)酸型 含磺酸基團(tuán) (R-SO3H) 中等酸型 含磷酸基團(tuán) (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 陰離子交換樹(shù)脂 強(qiáng)堿 含季胺基團(tuán) -N+(CH3)3 弱堿 含叔胺、伯胺基團(tuán)-N(CH3)2 陰離子交換樹(shù)脂對(duì)化學(xué)試劑及熱都不如陽(yáng)離子交換樹(shù)脂穩(wěn)定。,2.離子交換纖維素 陰離子交換纖維素 如:DEAE-纖維素 pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì),具二乙胺乙基 陽(yáng)離子交換纖維素如:CM-纖維素 一般pH4條件下使用,具有羧甲基,3.離子交換凝膠 分離大分子物質(zhì) 如：葡聚糖（Sephadex）、 聚丙烯酰胺（PAG）、瓊脂糖（Sepharose）,三、操作注意

4、點(diǎn),（一）離子交換劑的選擇 原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇同一性質(zhì)離子交換劑中選用對(duì)被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差異大的型號(hào)交換劑，以保證通過(guò)離子交換層析后能得到比較滿(mǎn)意的結(jié)果。,考慮因素： 1.被分離物質(zhì)帶何種電荷 2.被分離物質(zhì)分子的大小 大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素 3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境 4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì) 5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量,根據(jù)分離過(guò)程的實(shí)驗(yàn)條件 強(qiáng)酸強(qiáng)堿應(yīng)用廣泛 弱酸型只能在堿性pH范圍內(nèi)使用 弱堿型只能在酸性pH范圍內(nèi)使用,（二）緩沖液的選擇 原則：不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所帶電荷應(yīng)與樣品一致。避免使樣品變性,(三)洗脫劑 原則：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的

5、離子或基團(tuán) 改變pH或離子強(qiáng)度 增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力 降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力 洗脫方式：梯度洗脫,四、應(yīng)用,分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子,離子交換層析法分離氨基酸及測(cè)定,原理,所用樣品為天冬氨酸和賴(lài)氨酸的混合液，分別屬酸性氨基酸(pI2.77)、堿性氨基酸(pI9.74)，在緩沖溶液中分別帶正電荷和負(fù)電荷，與強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂Dowex50親和力有很大不同，在一定的洗脫條件下洗脫，將它們分離。利用氨基酸可與茚三酮反應(yīng)生成有色化合物進(jìn)行氨基酸鑒定。,紫色物質(zhì)，用于氨基酸的比色測(cè)定和紙層析顯色,與水含茚三酮的反應(yīng)：,Asp Lys pH4.2 pH 10,器材

6、,1. 層析柱等 2. 沸水浴,試劑,Dowex50 2mol/L NaOH pH5.3檸檬酸緩沖液 樣品液：氨基酸混合液 茚三酮混合液,實(shí)驗(yàn)步驟 1樹(shù)脂的處理 將干的強(qiáng)酸型樹(shù)脂用蒸餾水浸泡過(guò)夜，使之充分溶脹。用4倍體積的2mol/L的鹽酸浸泡1小時(shí)，傾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氫氧化鈉處理，做法同上。最后用欲使用的緩沖液浸泡。 2裝柱 取直徑1cm,長(zhǎng)度1012cm的層析柱。將柱垂直至于鐵架上。自頂部注入上述經(jīng)處理的樹(shù)脂懸浮液，關(guān)閉層析柱出口，待樹(shù)脂沉降后，放出過(guò)量溶液，再加入一些樹(shù)脂，至樹(shù)脂沉降至8 10cm的高度即可。 裝柱要求連續(xù)、均勻，無(wú)紋格、無(wú)氣泡，表面平整。液面不低于樹(shù)

7、脂。,3平衡 將緩沖液瓶與恒流泵相連，恒流泵出口與層析柱入口相連，樹(shù)脂表面保留34cm液層，開(kāi)動(dòng)衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH與洗脫液相同。 4. 加樣 揭去層析柱上口蓋子，待柱內(nèi)液面至樹(shù)脂表面12mm關(guān)閉出口，沿管壁四周小心加入0.5ml樣品，慢慢打開(kāi)出口，同時(shí)開(kāi)始收集流出液。當(dāng)樣品液彎月面靠近樹(shù)脂頂端時(shí)，即刻加入少量檸檬酸緩沖液沖洗加樣品處數(shù)次，然后注入檸檬酸緩沖液至液面高34cm左右，接恒流泵。 5. 洗脫 以緩沖液洗脫，開(kāi)始用試管收集洗脫液，每管收集1mL，共收集6080管。,6洗脫及氨基酸的鑒定 向各管收集液中加1mL水合茚三酮顯色劑并混勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min后冷卻至室溫，再加入3mL的0.1%硫酸銅溶液。混勻，以收集液第2管為空白，測(cè)定A570波長(zhǎng)的光吸收值，以光吸收值為縱坐標(biāo)，以洗脫液體積為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線(xiàn)。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)氨基酸的解離性質(zhì)，分析該實(shí)驗(yàn)