1、Y染色體微缺失檢測迪安醫(yī)學檢驗中心,1,學習交流PPT,一、背景,1 全球不育夫婦占已婚夫婦10%-15% 2 其中男性原因占40%-50% 3 遺傳因素占男性不育的30% 4 10%15%的特發(fā)性無精癥存在 Y 染色 體的微缺失,2,學習交流PPT,二 Y染色體微缺失相關基因,Y染色體是最短的近端著絲粒染色體 ,是男性特有的染色體。1976年，Tiepolo和Zuifaidi首先提出Y染色體上有多個基因參與生精過程。多年研究，發(fā)現(xiàn)男性特有的Y染色體上面存在一個關鍵的與生育相關的因子的區(qū)域，稱為AZF區(qū)。目前認為在AZF區(qū)上存在四個精子發(fā)生亞區(qū)（AZFa、AZFb、AZFc、AZFd），各亞區(qū)

2、包含的位點在男性生殖細胞發(fā)育的不同時期起著不同的作用，位點的缺失可致患者表現(xiàn)為少、弱精癥或無精癥從而引發(fā)不育。 一般認為，Y染色體的近端缺失（涉及AZFa和AZFb），表現(xiàn)以唯支持細胞綜合癥為主的嚴重生精障礙，Y染色體的遠端缺失（涉及AZFd和AZFc），可殘留島狀的生精正常區(qū)域。對無精癥患者中，對檢查睪丸過小或睪丸活檢仍無精子患者，一般不再行AZF基因檢測?？傊_展染色體和AZF檢測，可全面評價男性不育遺傳缺陷，從而更好的解釋發(fā)病原因，提供遺傳咨詢和指導臨床診療。 1996年將 AZF區(qū)劃分為 3個區(qū):AZFa、AZFb、 AZFc。1999 年研究發(fā)現(xiàn)在 AZFb 和 AZFc 間存在A

3、ZFd。研究發(fā)現(xiàn) ,在 Y染色體 AZFa、 AZFb、 AZFc3個區(qū)至少發(fā)現(xiàn) 15個與精子發(fā)生相關的基因，AZFd區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)相關基因。,3,學習交流PPT,二 Y染色體微缺失相關基因,AZFa缺失的病人 , 主要表現(xiàn)為唯支持細胞綜合征伴睪丸體積縮小 ,無精子生成 AZFb缺失的病人主要表現(xiàn)為生精過程阻滯在精母細胞階段 ,無精子生成 AZFc區(qū)缺失病人表現(xiàn)多樣化 ,會出現(xiàn)無精子癥和少精子癥的不同臨床表現(xiàn),4,學習交流PPT,二 Y染色體微缺失相關基因,AZFa缺失患者 33%為嚴重少精子,67%表現(xiàn)為無精子 AZFb缺失患者 9%輕度少精子, 23%嚴重少精子 , 68%無精子 AZFc缺失

4、患者 46%嚴重少精子 , 54%無精子,5,學習交流PPT,二 Y染色體微缺失相關基因,AZFa - b缺失患者 50%嚴重少精子50%無精子 AZFa - c缺失患者 100%無精子 AZFb - c缺失患者 4%嚴重少精子 , 96%無精子,6,學習交流PPT,二 Y染色體微缺失相關基因,AZFa缺失較為少見 ,占整個 AZF缺失 4 .9%。整個 AZFa區(qū)域缺失通常表現(xiàn)為 SCOS,為絕對的無精子癥。若患者為 AZFa缺失 ,不建議做睪丸穿刺尋找精子進行卵細胞胞質內單精子注射，目前只能尋求供精人工授精技術來獲得妊娠。,7,學習交流PPT,二 Y染色體微缺失相關基因,AZFb缺失也不多

5、見 ,占整個 AZF缺失 15 .8%。缺失的典型睪丸組織學特征是精子成熟障礙,主要停滯在初級精母細胞階段。但也有 SCOS的報告，睪丸穿刺不能獲得精子 ,因此 ,臨床上也不建議做睪丸穿刺。,8,學習交流PPT,二 Y染色體微缺失相關基因,AZFc缺失是臨床上最常見的 AZF缺失類型 ,臨床和睪丸組織學表型多種多樣。一般說來 ,AZFc缺失患者尚存精子生成能力。AZFc缺失見于無精子癥或嚴重少精子癥患者 ,罕見情況下 ,也可以在自然狀態(tài)下遺傳給其男性后代 在無精子癥患者中,AZFc缺失者通過睪丸精子穿刺獲得精子的機會比其他缺失類型大 ,同時可以從睪丸穿刺獲得精子進行 I CSI受孕 ,但這些患

6、者的男性后代都將是 AZFc缺失的攜帶者，建議在進行試管嬰兒前 ,行遺傳咨詢。,9,學習交流PPT,三 AZF微缺失與其他不育因素,AZF微缺失與隱睪癥 AZF微缺失與精索靜脈曲張 AZF微缺失與雙側輸精管缺如 AZF微缺失與睪丸支持細胞 AZF微缺失與生殖激素異常 AZF微缺失與其他不育因素,10,學習交流PPT,四 染色體微缺失的檢測方法,核型分析總體上來說操作繁瑣、效率不高, 尤其是難以檢測出微小的染色體異常或變異。熒光原位雜交(Fluorescence isitu hybridization, FISH)雖然有更高的分辨率, 但其檢測的范圍為 20 kb5 Mb,對于微小的染色體缺失也

7、難以檢測, 且繁瑣的實驗操作與高昂的成本也限制了 FISH 技術在臨床中的廣泛應用。,11,學習交流PPT,四 染色體微缺失的檢測方法,目前關于 染色體微缺失的檢測方法最常用 的是多重聚合酶鏈反應 () 技術 而檢測的位 點有很多 但有研究表明 - 和 這 個基因標志物能覆蓋大部分已發(fā)現(xiàn) 的微缺失 其他的位點序列靈敏度比較低, 當然不 同種族間可能會有輕微的差異,12,學習交流PPT,四 染色體微缺失的檢測方法,由于不 同實驗室采用 P C R方法不 同,導致實驗結果各異。為提高診斷質量， 歐洲男科協(xié) 會( E A A ) 和歐洲分子遺傳實驗質控網(wǎng)( E MQ N) 在 1 9 9 9 、 2

8、 0 0 4年先后頒布了第 1版和第 2版 Y染色體 微缺失分子診斷指南， 規(guī)范了檢測微缺失時的Y 染色體序列標簽點( s e q u e n c e t a r g e t e d s i t e s ，S T S ) 與 所采用的內外對照方法。,13,學習交流PPT,四 染色體微缺失的檢測方法,選擇位于 Y染色體短臂 ( Y p ) 的睪丸決定基因( S RY ) 和鋅指蛋白基因( Z F X Z F Y ) 為對照。Z F X Z F Y既存在于 x染色體短臂， 也存在于 Y p ， 其與 S R Y一起構成2個 目前推薦使用 的參照基因。每個 A Z F區(qū)域至少設置2個 S T S位點

9、 才能正確有效. 其推薦的 S T S為 A Z F a ： s Y 8 4， s Y 8 6：A Z F b： s Y 1 2 7， s Y 1 3 4； A Z F c ： s Y 2 5 4， s Y 2 5 5 。多重 P C R 實驗 中的引物應包括 ： s Y 1 4 ( S R Y ) ， z FY， ， s Y 8 4， s Y 8 6 ， s Y 1 2 7 ， s Y 1 3 4 ， s Y 2 5 4 ， s Y 2 5 5 。,14,學習交流PPT,五 染色體微缺失相關基因研究的意義,1 用于原發(fā)性無精或少弱精癥的遺傳咨詢。通過遺傳病因診斷， 找到男性不育的遺傳病因，

10、則可避免不必要的藥物及手術治療。 2 進行輔助生育之前對其進行遺傳病因診斷，可盡量避免將不良基因傳遞給下一代 3 輔助生育精子質量篩選 4 為未來的基因治療提供理論依據(jù)。,15,學習交流PPT,染色體微缺失相關基因研究的意義,為臨床治療各種男性不育提供分子或細胞水平的依據(jù)， 染色體微缺失雖然不會影響身體健康和心理健康 ，但會導致后代出現(xiàn)同樣的不育問題 對于不育夫婦 ，特別是無精子癥和嚴重少精癥的不育夫婦，雖然其可以通過 達到妊娠的目的 ，并且有正常的胚胎發(fā)育和足月妊娠， 但在接受 治療之前有必要進行 染色體微缺失的檢測以及移植前遺傳診斷， 盡量選擇女嬰， 切斷遺傳途徑。,16,學習交流PPT,

11、EGFR突變與非小細胞肺癌酪氨酸激酶抑制劑靶向治療,17,學習交流PPT,一 背景,肺癌是當今世界上最常見的惡性腫瘤 ,男性肺癌占各類惡性腫瘤發(fā)病率的首位 ,女性肺癌發(fā)病率僅次于乳腺癌占第 2位。 盡管手術和化療技術不斷提高 ,但肺癌患者的預后仍然很差 , 5年生存率仍 20%。 近年來隨著分子生物學技術的提高 ,產生了一些針對分子靶點的抗腫瘤藥物。這些藥物針對性強 ,能特異性地殺傷腫瘤細胞。 其中以表皮生長因子受體 ( epidermal growth factor receptor, EGFR)為靶點的分子靶向治療 (molecular targeted therapy)在非小細胞肺癌的治

12、療中日漸突出。,18,學習交流PPT,EGFR屬于受體酪氨酸激酶 ( recep t or tyrosine kinases, RTKs) ,調控細胞的生長、 分化、 血管生成及凋亡抑制 ,其信號通路與惡性腫瘤的生長、 侵襲及轉移關系密切。 靶向藥物稱作酪氨酸激酶抑制劑 ( tyr osine kinases inhibit ors, TKIs) ,其中吉非替尼 (Gefitibib,商品名為 Iressa 易瑞沙)和埃羅替尼 ( Erlotinib,商品名為 Tarceva 特羅凱)治療可以使腫瘤縮小。 在 Gefitibib和 Erlotinib的臨床試驗和治療中 ,僅有一部分 NSCLC

13、人群對藥物有反應,19,學習交流PPT,發(fā)現(xiàn)幾乎所有對 TKIs敏感的 NSCLC患者都存在EGFR基因的體細胞突變。因此 ,研究 NSCLC患者不同治療反應性的機制、 以及從中篩選出最適治療對象進行有針對性的治療具有重要臨床意義。,20,學習交流PPT,EGFR基因突變與 TKIs治療敏感性,文獻報道：肺癌細胞中 EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)基因突變是靶向藥物奏效的一個必要前提條件,研究結果顯示,對 EGFR突變型 NSCLC, Gefitinib的有效率高達80%以上 ,而對野生型腫瘤則基本無效。這一研究隨后被相繼其它研究所證實。,21,學習交流PPT,EGFR基因位于 7號染色體短臂 7p1

14、214區(qū),由 28個外顯子組成。EGFR在許多腫瘤中過表達,與腫瘤的生長侵襲及轉移密切相關。 在肺癌中,EGFR突變多出現(xiàn)于外顯子 1821區(qū)。最常見的突變包括 19區(qū)的缺失突變 ( deleti on)和 21區(qū)的點突變 (point mutati on) ,這兩種突變約占所有 EGFR突變的 85%90%。,22,學習交流PPT,外顯子 19區(qū)的堿基缺失主要是第 746752位密碼子的缺失突變 ,導致 EG2FR蛋白中氨基酸序列丟失 ,這一缺失改變了受體酪氨酸激酶 ATP結合槽 (ATP2 binding cleft)的角度 ,從而改變了細胞對 TKIs的敏感性。 外顯子 21的點突變主要

15、是第 858位密碼子出現(xiàn) TG轉換 ,引起 EGFR蛋白中該位點的氨基酸由亮氨酸轉變?yōu)榫彼?簡稱 L858R) ,此種結構改變也使細胞對 TKIs的敏感性發(fā)生變化,23,學習交流PPT,其他 EGFR突變比較少見 ,包括外顯子 18區(qū)的點突變和外顯子 20區(qū)的插入突變,24,學習交流PPT,TKIs治療耐受與 EGFR二次突變,并不是所有的 EGFR突變都會導致對 Gefitinib或 Erl otinib敏感性的增加,對 Gefitinib或 Erl otinib最初有反應的患者可發(fā)生二次突變而出現(xiàn) TKI治療耐受。如 T790M,發(fā)生在 EGFR外顯子 20區(qū) ,編碼的蘇氨酸轉變?yōu)榧琢虬?/p>

16、酸;氨基酸的改變導致了ATP結合區(qū)結構改變 ,使得細胞對 TKIs的敏感性降低。T790M突變也可出現(xiàn)在未做治療的患者中 ,因此 ,對于 EGFR不同突變的功能有必要進一步研究 ,以明確某個或某幾個突變是篩選適合 TKIs治療患者的最佳指標。,25,學習交流PPT,EGFR基因擴增和 CA重復序列的多態(tài)性,表達 EGFR或存在 EGFR基因擴增的患者對 Erlotinib治療反應好 ,并且生存率得到明顯提高。 研究發(fā)現(xiàn)：EGFR的高拷貝數(shù)與對藥物較好的反應率、 疾病控制率和存活率相聯(lián)系。 EGFR蛋白的高表達與好的治療結果之間的關聯(lián)度則次之。 同時 EGFR突變與較好的反應率和預后有關。,26

17、,學習交流PPT,但進一步的統(tǒng)計分析表明只有高的 EGFR基因拷貝數(shù)對應較高的存活率。 因此說明 , EGFR基因擴增可作為篩選 TKIs治療的指標之一。,27,學習交流PPT,研究發(fā)現(xiàn) ,位于 EGFR內含子 1的 CA重復序列的多態(tài)性可影響 EGFR的蛋白表達 ,低重復 CA數(shù)患者 EGFR的 RNA和蛋白表達高于高重復 CA數(shù)的患者 ,體外實驗也證實低重復 CA數(shù)細胞對 Gefitinib的敏感性較高。,28,學習交流PPT,EGFR家族其他成員 HER2/HER3,HER2可與 EGFR結合形成異源二聚體 ,引發(fā)受體自身磷酸化過程。有研究認為 , HER2 2基因拷貝數(shù)增加的腫瘤對 Gefitinib更敏感。但亦有研究發(fā)現(xiàn) , F ISH (原位熒光雜交 )檢測 HER2或 HER3陽性腫瘤與陰性腫瘤相比 ,兩組患者的病程進展時間及平均存活時間均沒有顯著差異。但是在體外細胞株的實驗中 ,不論有無 EGFR 突變存在,HER2和 (或 ) HER3高表達的細胞表現(xiàn)出對 Gefitinib較高的敏感性。,29,學習交流PPT,K-RAS基因突變,K-RAS是 EGFR信號通路下游的基因。與 EGFR基因突變相反 , K-RAS突變常見于吸