1、 中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文ABCE1基因?qū)π〖毎伟┰鲋?、侵襲、遷移能力影響的研究姓名：黃波申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：胸外科指導(dǎo)教師：田大力20090401 能力影響的研究的細胞凋亡過程，并可能在促進蛋白質(zhì)合成及細胞增殖分化過程中發(fā)揮著作用。因 膜細胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染的和轉(zhuǎn)染甋組細胞明顯減少，而轉(zhuǎn)染 甋的細胞和對照組細胞。流式細胞儀檢測顯示轉(zhuǎn)染結(jié)論使其增殖能力下降，降低其侵襲、遷移能力并誘導(dǎo)細胞凋亡。曬菇薃基因沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小細胞肺癌細胞系，這將為今后應(yīng)關(guān)鍵詞 產(chǎn)瓵 ，疦， ，籗 吼伽狝，琤 ； 申請學(xué)位論文與資料若有不實之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任本人完全了解中國醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研

2、究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬中國醫(yī)科大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為中國醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容苣諶莩以采用影印、縮印或其他手段保存論文。指導(dǎo)教師簽名：星盔左日 物細胞胞漿內(nèi)編碼一種名為核糖核酸酶的蛋白。細胞內(nèi)丫巰佘賬，琑含量 主要試劑 聚丙烯酰胺凝膠大連公司美國公司德國公司二、方法細胞培養(yǎng)將瓾赴諍G宓嘌珻孵箱中培養(yǎng)，標(biāo)本處理，冰箱保存。 超速離心，撼逡合茨。顯色，漂洗并干燥后避光保存。結(jié)果：以膜

3、上出現(xiàn)清晰的棕褐色條帶為陽性，應(yīng)用凝膠 統(tǒng)計學(xué)處理采用一、免疫組織化學(xué)結(jié)果糶員澩锫式細分別為，苑巫櫓蠥表達率較低肺癌組織，但二者差異無顯著性赴偉赴晗赴蠥表黧瓣圖珹在小細胞癌轉(zhuǎn)移 岷喜種破浠钚浴盚病毒感染時，直懷莆猂種埔蜃印鏡丁芯恐怠苡胂赴赗特異 結(jié)論 遷移能力的影響，二者的治療和預(yù)后截然不同。小細胞肺癌約占全部肺癌，其惡性程度高、發(fā)展迅速、早期可有遠處廣泛的轉(zhuǎn)移，確診時病人已有臨床或亞臨床的淋巴或血行轉(zhuǎn)移，自然病程短。小細胞肺癌對放、化療敏感，近期療效好，緩解率可達，但以上的患者治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲是治療失敗患者死亡的主要原因【，因此尋找新的途徑治療小細胞肺癌尤顯重要。研究

4、表明，小細胞肺癌的發(fā)生是一個多基因參與的，通過不同基因、在不同時相差異表達進行調(diào)控的復(fù)雜過程【。由于目前發(fā)現(xiàn)的與小細胞肺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因較為罕見，尋找新的小細胞肺癌差異表達基因，并確定其在小細胞肺癌中的作用，對于小細胞肺癌的診斷、預(yù)防和治療均具有重要的意義。本研究在應(yīng)用差異顯示方法篩選出小細胞肺癌差異表達產(chǎn)物片段 是近年來研究生物體基因表達、調(diào)控與功能的一項嶄新技術(shù)，赟璉起的生物細胞內(nèi)同源基它利用了由小干擾有紅褐色熒光的一、菌株和質(zhì)粒及引物 瓻質(zhì)粒圖譜均購于大連寶生物公司。引物璉物：珿”門籘鏚籘玎灶烈 質(zhì)粒提純試劑盒大連寶生物公司大連寶生物公司大連寶生物公司大連寶生物公司大連公司 美

5、國公司， 英國公司方法提取瓾赴躌 上 抑制酶性片段并測序。 使用殛苴旦投鴕飌狣進 介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染蠹尤雔稱取奐粒臱燒杯中，加琾在磁力攪拌器上攪拌的微孔濾器除菌，分裝藎保存。 波長的酶標(biāo)儀，測定各孔的吸光度值。轉(zhuǎn)染后細胞侵襲能力的檢測鮒刈榛啄窒笛將轉(zhuǎn)染甋、甋及甋細胞和未轉(zhuǎn)染的細胞共四組進行如下操作：小室為一杯狀結(jié)構(gòu)，杯底為孔徑的聚碳酸脂微孔濾膜封閉。轉(zhuǎn)染后細胞遷移能力的檢測赴凼笛瓾赴臀醋H鏡腘，細胞共四組進行如下操作卜二 流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染后細胞凋亡隊蚻，內(nèi)上流式細胞儀檢測。以瓾赴腡大小厥誅進窿一一圖珹片段電泳結(jié)果，為腜產(chǎn)物電泳結(jié)果，8視湍潰磷 圖厥盞腁電泳結(jié)果將鎘雙連接后，熱轉(zhuǎn)化、涂布平板過夜培

6、養(yǎng)菌體，挑選序列一致，表明甌質(zhì)粒構(gòu)建成功。 狣使用狝質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖柿雙酶切后電泳，1幻蓋瀉髉危為被酶切后臺目 結(jié)果 胦狣，狝質(zhì)粒電泳結(jié)果狝 細胞細胞細胞 圖，轉(zhuǎn)染腘瓣蕊 圖，陰性對照轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后各組細胞略腫脹，轉(zhuǎn)染猄的細胞增殖飄圖，不同組生長曲線圖 圖，轉(zhuǎn)染腘 “。培養(yǎng)螅勐運跣分別為纋，。 圖，轉(zhuǎn)染的 酆蠹純蹋髯榧洳鉅煳尷災(zāi)。酆，各組間差異無顯著性。酆，與楸冉螾：與楸冉螾；橛隻組以及 靜盡鮐秏圖，討論小細胞肺癌是一種惡性度極高的腫瘤，早期易發(fā)生淋巴和血行轉(zhuǎn)移。研究表與小細胞肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。 來自海洋生物維多利亞水母的綠色熒光蛋白進其的起始翻譯從而調(diào)控基因表達，使目的基因在真核細胞中的

7、表達顯著的表達定位情況。另外利用的熒光特性，可以定量檢測該載體的轉(zhuǎn)染和表 并使之降解，從而誘導(dǎo)基因的沉默。饕S糜詒澩鐨腫恿縍，大小。該載體兩端分別帶有毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，存在致瘤的危險，腺病毒雖然有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率，但因不能整合入受者染色體，目的基因只能一過性表達，還存在著一些病毒所帶來的不可預(yù)測的體仍不失為一種好的選擇。它用于對目的基因的沉默研究可直接轉(zhuǎn)入宿主細胞。 尤氳較赴謝嵊盞枷赴蟯觥基因可能是轉(zhuǎn)染甋后小細胞肺癌細胞生物學(xué)行為發(fā)生改變的機制之一。隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，新技術(shù)的不斷進步，人類將會最終從基因水平和功能水平揭示肺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的確切機制。阻斷這些因素的發(fā)生、調(diào)節(jié)其功能將可能逆轉(zhuǎn)腫瘤

8、的侵襲與轉(zhuǎn)移，為實驗開發(fā)和臨床應(yīng)用新藥物及新療法、預(yù)防肺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供新的思路。結(jié)：口論，【 前言 入小細胞肺癌細胞，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染甋的小細胞肺癌細胞株，為進材料和方法一、材料菌株和質(zhì)粒購于上海閃晶生物公司。 蘇州安臺空氣技術(shù)公司倒置顯微鏡熒光顯微鏡青島海爾股份有限公司 畃甋載體構(gòu)建無核酸去離子水用富撼逡簂中，分別命名為疦，。，按照轉(zhuǎn)染試劑的比例加入構(gòu)建 跤玫淖H臼約罝混合液加入到裝逯信嘌蠹尤胎牛血清。H后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，轉(zhuǎn)染成功后，加入蛹尤隚牡周之間細胞開始出現(xiàn)大量死亡，存活的細胞形測序并電泳，可見構(gòu)建的質(zhì)粒約笮圖，選取陽性克隆的锝脅廡潁廡蚪峁肷杓頻男蛄幸恢圖。 籢籢一。一行

9、蘑鮐注栩蛆酬監(jiān)礎(chǔ)】，口疦質(zhì)粒測序結(jié)果圖菇驛 的細胞用槍挑至孔板，繼續(xù)培養(yǎng)并用半量養(yǎng)約芎笙赴緯山廈薌目寺圖，赴孔板，繼續(xù)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，、豨。在培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)約 翼滋一陽一狽狽細胞 露辮豳 鎏遴邃蕊圖在培養(yǎng)瓶繼續(xù)擴大培養(yǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株一 琑腺癌的發(fā)生、進展密切相關(guān)。蚴嗆頌嗆慫崦窵的抑制因子，同時也是展等生物學(xué)行為有關(guān)。我們在構(gòu)建騍表達載體的基礎(chǔ)上，將上述載體瞬時轉(zhuǎn)染小細胞肺癌細胞株瓾礎(chǔ)基因澩鐫靨錋、甋瞬時轉(zhuǎn)染人小細胞肺癌細胞系瓾蟛喚隹梢種艫基因的表達，而且還能明顯的抑制其細胞生長，降低其侵襲、遷移能力并且誘導(dǎo)細胞凋亡。為了進一步進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染我們重新構(gòu)建了虻腟表達 說明書進行預(yù)試驗時，我

10、們應(yīng)用了不同的脂質(zhì)體與核苷酸的比例， 結(jié)論己稈鯝基因沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小細胞肺癌細胞株。 ；：，瓜旭，琣；：甆 籺，痙產(chǎn)： ， 坷咖 甊琓 琍，；：， 珼 琋，； 轪鮩 ： 甋轉(zhuǎn)染人小細胞肺癌細胞系， 肺癌相關(guān)基因研究進展 突變的基因是潁琑基因突變主要發(fā)生于琒萇俜鶵基因蟯槐渲浯嬖諉芮械墓叵怠贜乇鶚欠蝸侔?，R基因突變可以蚨揮諶死嗟湃舊宄，編碼分子量為蛋 基因是從赴馨土鮒屑隼吹陌潁揮諶巳舊，其基增殖從而遏制腫瘤形成的基因。抑癌基因的丟失或失活可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 基因 基因的表達，經(jīng)測定證實基因異常轉(zhuǎn)錄為其多個外顯子缺失所者中高達而非吸煙肺癌患者僅為，并認為陽畆基因可能作為吸煙引起肺細胞癌變前期的一個靶基因。蛋白頰咄庵苧V衧固褰屑觳猓的患者呈陽性，健康對可能通過抑制肺癌細胞凋亡，對肺癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用。 基因型即響細胞的發(fā)育、增殖、分化，與腫瘤發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。理分級組織中 癌中，關(guān)虼亢閑勻筆株有錯義突變和無意義突變。株非小細胞癌陽性表達在肺癌組織中明顯低于癌旁肺組織，與肺癌病理學(xué)類型、基因胞的生長受到抑制。靜脈內(nèi)注射脂質(zhì)體包埋的基因給種植細胞株的大擴增等逐漸被更多的研究人員所掌握，隨之越來越多的肺癌相關(guān)基因被人們發(fā)現(xiàn)認識，各個基因在肺癌發(fā)病過程中的作用也將被人們所熟知。但肺癌的發(fā)生是一