1、第六章 小 結(jié),植物體細(xì)胞雜交即原生質(zhì)體融合，是獲得胞質(zhì)雜種的理想途徑 體細(xì)胞雜交在遠(yuǎn)緣育種與新物種、新資源創(chuàng)造中具有深遠(yuǎn)意義 原生質(zhì)體融合技術(shù)主要有PEG融合和電融合 雜種的成功培養(yǎng)是建立在原生質(zhì)體的培養(yǎng)技術(shù)上的，選擇和鑒定是獲得細(xì)胞雜種的關(guān)鍵 提高融合效率和培養(yǎng)重復(fù)性是該技術(shù)研究的重點(diǎn) 細(xì)胞雜種是體細(xì)胞遺傳研究的良好體系,思考題1、原生質(zhì)體定義2、原生質(zhì)體分離、純化方法3、原生質(zhì)體融合方法及原理4、原生質(zhì)體融合的意義5、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法6、植物體細(xì)胞雜交的概念和類型7、體細(xì)胞雜種鑒定方法8、體細(xì)胞雜種應(yīng)用,植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù) 載體介導(dǎo)法, 如農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 DNA直接轉(zhuǎn)移法 植物生物

2、反應(yīng)器,第八章 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)的中心環(huán)節(jié)即為DNA重組技術(shù)，其最終目的是將DNA片段轉(zhuǎn)入為一個生物體，從而使該生物體具有表現(xiàn)某種性狀。 轉(zhuǎn)基因通過獲取基因、重組基因和表達(dá)基因等過程來實(shí)現(xiàn)。 轉(zhuǎn)基因打破了物種的界限，使不同種的生物的遺傳物質(zhì)在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，實(shí)現(xiàn)對生物體的改造。,8.1 植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù),目的基因克隆的基本步驟,分離獲得目的基因； 在體外進(jìn)行DNA重組，將外源DNA連接到能自我復(fù)制又帶有選擇標(biāo)記的載體上； 將重組DNA轉(zhuǎn)移入受體細(xì)胞； 篩選出含有目的DNA的受體細(xì)胞克??；,(1) 載體介導(dǎo)法, 如農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法,根瘤,存

3、在于能引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中，誘導(dǎo)冠癭瘤形成，又稱腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒（tumor inducing plasmid）。, Ti質(zhì)粒,轉(zhuǎn)移DNA，編碼冠癭堿的合成，能隨機(jī)整合到植物的染色體上。長度一般為12-24kb，是Ti質(zhì)粒最重要的部分。,T-DNA（transferred-DNA）,冠癭堿（opine）的作用,冠癭堿是在冠癭瘤內(nèi)合成并分泌出來的，是農(nóng)桿菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠癭堿。,毒性基因（vir）,決定土壤農(nóng)桿菌對植物的感染和T-DNA的轉(zhuǎn)移， 進(jìn)入和整合。,冠癭堿代謝基因,分別編碼代謝冠癭堿的酶。維持農(nóng)桿菌生長。,第一步:植物受傷,植物受傷后能分泌酚類化合

4、物（如乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮），誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的毒性基因表達(dá)。, 農(nóng)桿菌的感染和生存,第二步 感染植物,農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬ǔＴ谇o的基部）。,第三步 毒性基因（vir）表達(dá),T-DNA上的產(chǎn)物催化產(chǎn)生過量的生長素和細(xì)胞分裂素，形成植物冠癭瘤。,virA、virG、virD、virB,第四步 T-DNA轉(zhuǎn)移,第五步 誘導(dǎo)冠癭瘤,T-DNA被vir基因產(chǎn)物切下來，并運(yùn)送到植物細(xì)胞核里，整合到植物基因組中。,第六步 土壤農(nóng)桿菌代謝冠癭堿。,改造后的Ti質(zhì)粒載體模式,葉盤,消毒,切取,土壤農(nóng)桿菌浸泡,篩選培養(yǎng)基,愈傷組織,分化幼苗,優(yōu)點(diǎn): 多為單拷貝或寡拷貝整合，轉(zhuǎn)基因遺傳較 穩(wěn)定，減

5、少了共抑制等基因沉默現(xiàn)象 屬于單細(xì)胞轉(zhuǎn)化，不存在嵌合體現(xiàn)象； 成本較低，轉(zhuǎn)化效率較高。,植物細(xì)胞,原生質(zhì)體,纖維素酶和果膠酶,DNA,混合入電擊緩沖液,1-2kV, 3-25F電擊,愈傷組織,幼苗,分化,(2) DNA直接轉(zhuǎn)移法,電擊法,轉(zhuǎn)化效率較低，且僅限于能由原生質(zhì)體 再生出植株的植物。, 基因槍法（gene gun）,基因槍法最早是由美國康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出的。它通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過該法獲得的。,又稱高速微粒轟擊法（High-velocity microprojecti

6、les),DNA,1.2m鎢彈頭,吸附,特制手槍,射擊植物,裝入,但進(jìn)去的DNA片段整合效率極低，不易獲得再生植株，可能發(fā)生共抑制現(xiàn)象.,基因槍法（gene gun）,8.2 植物生物反應(yīng)器,植物生物反應(yīng)器是指通過基因工程途徑，以常見的農(nóng)作物作為“化學(xué)工廠”，通過大規(guī)模種植生產(chǎn)具有高經(jīng)濟(jì)附加值的醫(yī)用蛋白、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂類及其它一些次生代謝產(chǎn)物等生物制劑的方法。,在植物生物反應(yīng)器研究中，最受人們關(guān)注同時研究進(jìn)展也最快的是生產(chǎn)各種疫苗用的抗原蛋白。 疫苗的形式也由菌體疫苗發(fā)展到亞單位疫苗（Subunitvaccine），甚至還產(chǎn)生了DNA疫苗。,8.2 植物生物反應(yīng)

7、器,1992年，美國人C.J.Arntzen和H.S.Mason率先提出了用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗的新思路。 此后，國內(nèi)外多個實(shí)驗(yàn)室相繼在煙草、馬鈴薯、番茄、苜蓿和萵苣中表達(dá)了乙肝表面抗原、大腸桿菌熱敏毒素B亞基、霍亂毒素B亞基、諾瓦克病毒殼蛋白和狂犬病毒G蛋白等抗原，并利用在植物中表達(dá)的抗原進(jìn)行了動物和人體的免疫實(shí)驗(yàn)，獲得了大量有價值的研究數(shù)據(jù)，為今后利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗奠定了良好基礎(chǔ) 。,植物來源的重組藥用蛋白第一次臨床應(yīng)用研究是由星球生物技術(shù)有限公司（PlanetBiotechnology,Inc）. 美國著名的孟山都公司（Monsanto）已經(jīng)培育出一種轉(zhuǎn)基因玉米，每公頃玉米可以產(chǎn)生3.

8、7公斤達(dá)到藥用蛋白標(biāo)準(zhǔn)的人類抗體。 植物來源的抗體在體外的穩(wěn)定性和體內(nèi)的生物活性與動物細(xì)胞培養(yǎng)來源的抗體是相同的，利用它將開發(fā)出一種低成本的治療方法來防治某些由性傳播的疾病。,LargeScaleBiology公司和斯坦福大學(xué)已經(jīng)合作開發(fā)了一種腫瘤特異性疫苗，可用于阻止細(xì)胞的惡性生長，它們利用植物病毒作為瞬時表達(dá)系統(tǒng)。 治療的目的是在患者體內(nèi)產(chǎn)生特殊的抗體，它能特異性識別惡性生長的B細(xì)胞表面特異性位點(diǎn)，使靶細(xì)胞最終受到破壞，而正常的細(xì)胞不會受到任何影響。 另外一個引起全球關(guān)注的研究成果是，瑞士聯(lián)邦技術(shù)研究所, 在2000年將水仙的八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素環(huán)化酶基因?qū)胨?，研制出一種富含胡

9、蘿卜素（維生素A前體）的水稻，品種名稱T309，每克稻米含1.6mg胡蘿卜素，由于稻米色澤金黃，故稱為“金色大米”。,我國植物生物反應(yīng)器的研究始于上世紀(jì)90年代初期，雖然在構(gòu)建高效植物表達(dá)載體和培育轉(zhuǎn)基因植物等主要技術(shù)環(huán)節(jié)上與國外相差無幾，但在研究的廣度和深度上與發(fā)達(dá)國家相比卻存在很大差距。 幸運(yùn)的是，在制訂“九五”，“十五”“863”計劃時，選擇了“利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗和生物可降解塑料”等研究課題予以資助。已取得較多的研究成果。,我國植物生物反應(yīng)器的研究和利用還主要集中在藥用蛋白的研究和應(yīng)用方面。而利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)特殊飽和或不飽和脂肪酸、改性淀粉、環(huán)糊精或糖醇、次生代謝產(chǎn)物、工農(nóng)業(yè)用

10、酶制劑的研究仍然沒有引起國家足夠的重視，其實(shí)，這些生物制劑的市場潛力也是非?？捎^的。 如利用轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)植酸酶，在加工成動物飼料添加劑后，可有效降低家畜排泄物中的磷含量，這對于降低水污染和保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面很有意義。,目前，利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的大多數(shù)治療用血液蛋白幾乎都是在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)出來的。該系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是所表達(dá)的重組蛋白能夠進(jìn)行正確的折疊及完成其他翻譯后加工過程的機(jī)會比較高，然而，有許多因素仍然限制哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，這些因素包括： 1）即使在最適的培養(yǎng)條件下，重組蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)水平仍很低，通常為每天每升數(shù)十毫克； 2）重組蛋白最后必需從培養(yǎng)液中分離提純出來，這會進(jìn)一步導(dǎo)致產(chǎn)量損失和增加生產(chǎn)成本；,3）哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)日常維護(hù)費(fèi)用非常高，這也使產(chǎn)品的生產(chǎn)成本居高不下； 4）哺乳動物細(xì)胞對外力比較敏感，而振蕩培養(yǎng)通常又是工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)所不可缺少的，這就使擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模變得相當(dāng)困難； 5）胎牛血清是哺乳動物細(xì)胞生長所不可缺少的，它的價格昂貴，而且不同批次之間成份相差很大，這些變化會導(dǎo)致細(xì)胞的生長情況不一致，進(jìn)而影響到細(xì)胞發(fā)酵過程及下游的提純加工過程； 6）哺乳動物細(xì)胞對一些環(huán)境因素如溫度、pH值、含氧量和次生代謝產(chǎn)物的變化非常的敏感，因此需要對培養(yǎng)條件進(jìn)行精確