1、紫杉醇的發(fā)酵培養(yǎng),楊海望 植物專業(yè) 學(xué)號(hào)021142063,腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人們生命和生活質(zhì)量的重大和主要疾病。我國(guó)國(guó)內(nèi)每年新發(fā)生癌癥患者160 萬(wàn)人, 并有130 萬(wàn)人死于癌癥。發(fā)達(dá)國(guó)家美、歐、日等每年新增的癌癥患者達(dá)400 萬(wàn)人左右, 全世界癌癥死亡人數(shù)每年達(dá)630 萬(wàn)人。長(zhǎng)期以來(lái), 尋找抗癌生物資源與天然藥物成為各國(guó)醫(yī)藥、化學(xué)及生物學(xué)家的一個(gè)共同愿望。,美國(guó)西部山區(qū)有一片紅豆杉林，山林中有一個(gè)小村鎮(zhèn)，住著2000多居民。這個(gè)小村鎮(zhèn)雖然不大，卻以長(zhǎng)壽而聞名美國(guó)。小村鎮(zhèn)里，壽命最短的人都活到95歲以上，絕大多數(shù)人的壽命都在100歲以上，百歲壽星處處可見(jiàn)！,這則新聞吸引了不少科學(xué)家的目光，紛

2、紛到這來(lái)考察，然而他們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這里人的奇異之處，飲食生活與其他地區(qū)人群并無(wú)太大差別。仔細(xì)觀察以后，發(fā)現(xiàn)這里的居民有兩個(gè)與紅豆杉有關(guān)的生活習(xí)慣，一是他們好采摘紅豆杉樹(shù)葉泡茶喝;二是經(jīng)常到紅豆杉樹(shù)林中散步或者運(yùn)動(dòng)。,這種現(xiàn)象引起了科學(xué)家的極大興趣。經(jīng)過(guò)不懈努力，美國(guó)施寶貴公司于1992年從紅豆杉中提取出天然抗癌物質(zhì)紫杉醇。接著，英國(guó)、俄羅斯、韓國(guó)和中國(guó)的科研人員也都從中提取出這種珍貴的藥物。,但是，人們發(fā)現(xiàn)紫杉醇具有獨(dú)特的抗腫瘤作用，能夠顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)晚期卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卡波濟(jì)肉瘤等療效確切，而且副作用很小。當(dāng)世界各國(guó)都為無(wú)法攻克癌癥而焦灼的時(shí)候，紅豆杉中紫杉醇的發(fā)現(xiàn)像一棵

3、救命的靈芝草，給癌癥患者帶來(lái)了生的希望。,副作用,紫杉醇的抗癌機(jī)理,紫杉醇能選擇性地與微管蛋白結(jié)合, 促進(jìn)微管蛋白雙聚體聚合為多聚體。對(duì)迅速分裂的腫瘤細(xì)胞,紫杉醇凍結(jié)有絲分裂紡錘體, 從而使有絲分裂停止在G2 期和M 期, 阻止了癌細(xì)胞的快速繁殖直至死亡。作用于巨噬細(xì)胞上的腫瘤壞死因子( TNF) 受體, 促使釋放白細(xì)胞介質(zhì)IL21 、TNF22 、IL26 、干擾素( IFN) 21 、IFN22 , 對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷或抑制作用; 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 。,除此以外，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，紫杉醇的新用途也被不斷發(fā)現(xiàn)。據(jù)歐洲醫(yī)生雜志報(bào)道，紫杉醇對(duì)多種慢性頑癥有較好的治療作用，比如進(jìn)行性硬化癥、風(fēng)濕

4、性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、濕疹等，治療效果都不錯(cuò)。隨著時(shí)間的推移，紫杉醇的用途進(jìn)一步被人們所認(rèn)識(shí)，其治療適用范圍還會(huì)擴(kuò)大。,紫杉醇具有如此神奇的作用，本應(yīng)該進(jìn)行大面積、大量開(kāi)發(fā)紅豆杉。然而，不容樂(lè)觀的是，全世界每年紫杉醇的產(chǎn)量都在300千克以下，因?yàn)榧t豆杉是瀕臨滅絕的珍稀植物，是第三紀(jì)冰川期遺留下來(lái)的。 加之紫杉醇在樹(shù)皮中的含量極低,僅為干重的0.101 %0.106 % ,且生長(zhǎng)緩慢,植株成熟約需100 年。約36棵100 年左右的紅豆杉樹(shù)皮才能提取出用于治療一個(gè)癌癥病人所需求的紫杉醇。因此,紫杉醇來(lái)源仍將成為該藥長(zhǎng)期供應(yīng)的關(guān)鍵制約因素.,怎樣能獲得更多的紫杉醇？,人們想到了一些方法,人們從T.Me

5、dia“Hicksii”和T.Media“ Hill ”這兩種植物的根中提取到紫杉醇，含量紅豆杉屬植物的4 倍，但是大田種植,3 年才能收割一次，不太理想。 打破休眠 扦插,植物中提取,快速繁殖方法,全合成,Wender 的逆合成分析,巨大的社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益和極為重要的學(xué)術(shù)價(jià)值吸引了全球范圍內(nèi)的40 多個(gè)一流的研究小組從事紫杉醇的全合成工作.,Mukaiyama 的逆合成分析,1994 年初,Holto和Nicolaou 幾乎同時(shí)宣告紫杉醇的全合成獲得成功. 二者的全合成工作完成的十分出色,但合成路線均太長(zhǎng),且中間步驟的收率又相差很大,導(dǎo)致紫杉醇的最終收率均很低. 最高只能達(dá)到2. 7 %

6、，目前來(lái)看,紫杉醇的化學(xué)全合成還僅具有研究意義,缺少商業(yè)價(jià)值.,部分合成法（半合成法） 10 - 去乙酰巴卡亭，可從天然紅豆杉針葉中以0. 1 %的含量分離得到,為化學(xué)半合成提供了較豐富的原料。紫杉醇的半合成方法已比較成熟,國(guó)外已用半合成法生產(chǎn)紫杉醇。 離體細(xì)胞培養(yǎng)法 細(xì)胞系 誘導(dǎo)子 農(nóng)桿菌Ti 和 Ri 質(zhì)粒介導(dǎo) 愈傷組織褐化 發(fā)酵培養(yǎng)法,發(fā)酵培養(yǎng)法,首先，看看微生物發(fā)酵工程與醫(yī)藥及我們生活的關(guān)系 1、 抗生素 自1929年英國(guó)人發(fā)現(xiàn)青霉菌分泌青霉素能抑制葡萄球菌生長(zhǎng)以后，相繼發(fā)現(xiàn)了鏈霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四環(huán)素、新霉素和紅霉素等抗菌素.在近幾十年內(nèi)，抗生素的研究又有了飛速的發(fā)展，已

7、找到的抗生素有數(shù)千種，其中具有臨床效果并已利用發(fā)酵法大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用的多達(dá)百余種.,2、維生素類藥物 維生素作為六大生命要素之一，為整個(gè)生命活動(dòng)所必需.VA的前體-胡蘿卜素及VC和VE均為抗氧化劑，能保護(hù)人體組織的過(guò)氧化損傷并提高機(jī)體免疫力，有抗癌、抗心血管疾病和白內(nèi)障等功能. 就拿Vc為例，Vc的微生物發(fā)酵法早已取得重要突破，利用“大小菌落”菌株混合培養(yǎng)生產(chǎn)VC的工藝已經(jīng)成熟，進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化.目前利用氧化葡萄糖桿菌與一種蠟狀芽孢桿菌混合菌共固定化發(fā)酵技術(shù)，可將Vc的收率提高到80%以上，生產(chǎn)周期比傳統(tǒng)工藝縮短1/3.,3、醫(yī)用酶制劑 目前，我國(guó)每年約有60萬(wàn)人死于冠心病，約120萬(wàn)人死于腦梗塞

8、、腦溢血，而美國(guó)每年約有15萬(wàn)人死于中風(fēng)，約80%的病例是由于阻止血液流向大腦的血凝塊引起而導(dǎo)致突發(fā)性死亡，而通過(guò)微生物可以大量生產(chǎn)出高濃度和活力的溶栓酶，并且成本很低。,4、多烯脂肪酸 多烯脂肪酸，如-亞麻酸(GLA)和二十二碳六烯酸（DHA），是人體不能合成而又必需的多烯脂肪酸缺乏時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體代謝的紊亂而引起多種疾病，如高血壓、糖尿病、癌癥、病毒感染以及皮膚老化等. 海洋中有一種繁殖力很強(qiáng)的網(wǎng)粘菌SR21，其干菌體DHA含量為30%40%，可通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)DHA，每升培養(yǎng)液產(chǎn)量為4.5g。,紫杉醇的發(fā)酵培養(yǎng)法,一、原理：,人們發(fā)現(xiàn)紅豆杉內(nèi)生真菌也能產(chǎn)紫杉醇，這無(wú)疑為解決紫杉醇藥源危機(jī)提供了一

9、種新的途徑。,二、方法,將樹(shù)皮洗凈,用75 %酒精浸泡510 min 進(jìn)行表面消毒,再用無(wú)菌水沖洗,然后剪切成長(zhǎng)寬為1 cm 1 cm 的小塊, 接種于瓊脂培養(yǎng)基上, 于(24 1) 培養(yǎng)。待樹(shù)皮表面長(zhǎng)出菌絲后,挑取其菌絲尖端,進(jìn)行稀釋,接種到PDA 培養(yǎng)基上,使每個(gè)培養(yǎng)皿長(zhǎng)出13 個(gè)菌落,連續(xù)繼代純化8 次以上,得到純化菌株。,1) 內(nèi)生真菌的分離,多樣性,圖1 分離到的內(nèi)生真菌菌落IBPCZ3S,菌株IBPCZ3S 在PDA 培養(yǎng)基上菌落輪紋明顯,內(nèi)層黑褐色,邊緣白色,鋪展、致密、圓形,邊緣整齊,7 d 后出現(xiàn)輻射狀溝紋。,圖2 IBPCZ3S 菌株菌絲形態(tài)特征,菌絲無(wú)色,分枝,具有橫隔膜

10、。菌絲生長(zhǎng)較快,5 d后直徑達(dá)62m。孢子豐富,分生孢子穗炭黑色,圓形呈放射狀。分生孢子梗無(wú)色或呈現(xiàn)黃褐色,光滑,分生孢子小,球形,壁上有刺紋。,2) 內(nèi)生真菌的培養(yǎng),種子培養(yǎng)基: 液體培養(yǎng)基，將純化菌株接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子菌,3 d 后,取5 mL 液體種子菌轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中發(fā)酵。,發(fā)酵培養(yǎng)基：2.8L 和10L 小罐發(fā)酵方法：以3%接種量將種子培養(yǎng)液接入已滅菌(2.8L 小罐進(jìn)行實(shí)罐滅菌,10L 罐先空消,再用無(wú)菌壓縮空氣吹干后加入滅過(guò)菌的培養(yǎng)基)、冷卻的發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/ min ，28通風(fēng)培養(yǎng)1618d，定期測(cè)定發(fā)酵液中紫杉醇含量、生物量、總糖和pH 值。,3) 紫杉醇提取方

11、法,發(fā)酵液過(guò)濾，濾渣烘干（低于50），濾液稱量體積。濾渣用適量乙酸乙酯萃取，濾液用1/2 濾液體積的乙酸乙酯萃取，下層水層再用乙酸乙酯萃取一次，合并乙酸乙酯，減壓蒸干。用適量甲醇洗滌減壓蒸干的固體，加入乙酸乙酯和水11 (V/V)再進(jìn)行萃取，將收集的乙酸乙酯進(jìn)行減壓蒸干，用一定量的乙腈溶解固體，0密封保存。,超臨界CO2提取法 （SFT法）,超臨界流體萃取技術(shù)是近代化工分離中的一種新型分離技術(shù)，超臨界CO2萃取是采用CO2作溶劑，超臨界狀態(tài)下的CO2流體密度和介電常數(shù)較大，對(duì)物質(zhì)溶解度很大，并隨壓力和溫度的變化而急劇變化，因此，不僅對(duì)某些物質(zhì)的溶解度有選擇性，且溶劑和萃取物非常容易分離。超臨界

12、CO2萃取特別適用于脂溶性，高沸點(diǎn)，熱敏性物質(zhì)的提取，同時(shí)也適用于不同組分的精細(xì)分離，即超臨界精鎦。用超臨界CO2作溶劑對(duì)生物、食品、藥物等許多產(chǎn)物的提取和純化。,4) 紫杉醇的鑒定,薄膜層析，取標(biāo)準(zhǔn)品紫杉醇溶液2L ,樣品溶液10L ,分別點(diǎn)樣于硅膠板上,置于層析缸中展開(kāi),晾干,噴霧顯色。觀察斑點(diǎn)的大小、位置和顏色,目測(cè)估計(jì)紫杉醇及紫杉烷類化合物的含量。同樣，還可以用紫外吸收法或HPLC測(cè)定紫杉醇的含量,菌株的最高產(chǎn)率約為1 mg/ L,5) 優(yōu)化,研究培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對(duì)紫杉醇產(chǎn)量的影響 。,碳源的影響,選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖為碳源, 觀察其對(duì)菌體生長(zhǎng)和紫杉醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明

13、: 蔗糖和麥芽糖為碳源時(shí)紫杉醇含量相對(duì)較高, 在以葡萄糖和乳糖為碳源時(shí)含量較低。,氮源的影響,分別考查氯化銨、硝酸銨、硫酸銨和蛋白胨等氮源對(duì)菌株產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)量影響。結(jié)果表明:不同氮源對(duì)紫杉醇的產(chǎn)量影響較大。以氯化銨和硫酸銨為氮源時(shí),菌絲生長(zhǎng)較好, 紫杉醇產(chǎn)量明顯比以硝酸銨為氮源時(shí)高, 而以蛋白胨為氮源時(shí), 紫杉醇產(chǎn)量急劇下降, 可能是蛋白胨的某些成分抑制了紫杉醇的產(chǎn)生。,補(bǔ)加蔗糖的影響,總糖隨時(shí)間的變化關(guān)系,補(bǔ)加蔗糖量對(duì)菌體干重和紫杉醇產(chǎn)量的影響,發(fā)酵過(guò)程中24 h時(shí)補(bǔ)加蔗糖量對(duì)菌體生長(zhǎng)和紫杉醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明: 在一定范圍內(nèi), 隨補(bǔ)加蔗糖量的增加, 可以促進(jìn)菌體的新一輪生長(zhǎng)和繁殖, 且紫杉醇含量也增加, 而當(dāng)每升補(bǔ)加蔗糖量為30 g 時(shí), 菌體干重和紫杉醇產(chǎn)量都開(kāi)始下降。這可能因?yàn)樘菨舛忍岣叨鴮?duì)應(yīng)的提高了滲透壓, 導(dǎo)致膜蛋白部分降解, 使菌體通透性增加, 而使代謝物更多地向胞外釋放 , 促進(jìn)了產(chǎn)物的合成速率, 提高了產(chǎn)量, 但過(guò)高的糖濃度導(dǎo)致發(fā)酵液粘度增加, 菌體呼吸困難, 進(jìn)而抑制了紫杉醇的生產(chǎn)。,前體飼喂的影響,在內(nèi)生真菌的發(fā)酵過(guò)程中, 前體對(duì)紫杉醇有一定影響。結(jié)果表明, 與對(duì)照組相比較, 苯丙氨酸的濃度對(duì)紫杉醇的產(chǎn)量影響顯著,其原因可認(rèn)為苯丙氨酸為紫杉醇合成的底物。,三