1、單位及實(shí)驗(yàn)室名稱項(xiàng) 目編號：ASJYK-LAB-C-P-53日期：2015年6月21日版本：第一版，第1次修訂第1頁，共3頁檢驗(yàn)科HPV-DNA擴(kuò)增熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序1.目的：明確高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測的操作規(guī)程，指導(dǎo)檢驗(yàn)人員正確進(jìn)行巨細(xì)胞病毒核酸定量的檢測。2.適用范圍：2.1適用于進(jìn)行高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測的檢驗(yàn)人員。2.2適合儀器：LightCycler480型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀2.3方法原理：采用PCR方法結(jié)合熒光探針的擴(kuò)增技術(shù)2.4樣品要求：宮頸脫落細(xì)胞3.職責(zé)：實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.試劑來源：潮州凱普生物化學(xué)有限公司高危型人乳頭瘤病毒核酸定

2、量檢測試劑盒。5.質(zhì)控物：陰性、陽性對照及陽性參控品系列均來源于試劑盒6.標(biāo)準(zhǔn)操作：6.1 試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)操作）6.1.1將試劑盒及其它所需試劑置室溫解凍（臨用前取出，用后立即放回冰箱，反復(fù)凍融不可超過三次），取出PCR MIX,室溫下避光解凍，上下顛倒混勻后，8000轉(zhuǎn)/分鐘10s從試劑盒中取出DVA聚合酶，8000轉(zhuǎn)/分鐘lOs。6.1.2根據(jù)當(dāng)次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量，取出相應(yīng)試劑（1管=17.5ulPCR MIX +0.5ul DVA聚合酶）總的需求量于一管中（其余隨即放回原溫度保存），如所需要的管數(shù)為n (n=標(biāo)本數(shù)+1空白管對照+1管陽性對照) 取PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本制備區(qū)。6.2樣

3、本處理(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)6.2.1.取宮頸脫落細(xì)胞樣本0. 5ml1ml(如果細(xì)胞數(shù)量少可以加大體積到2m1)6.2.2. 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘6.2.3.棄上清，加入0.5m1細(xì)胞保存液重懸細(xì)胞6.2.4. 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，盡量棄干凈上清6.2.5.每樣本加入50ul細(xì)胞裂解液，充分振蕩重懸細(xì)胞，煮沸10分鐘。6.2.6. 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，保留上清備用(上清中為釋放的DNA)。6.2.7取上清2.0ul作為PCR擴(kuò)增的模板，其余保存于一206.2.8在對應(yīng)的PCR反應(yīng)管中分別加入2ul處理好的樣本DVA,空白對照、陽性對照，蓋緊管蓋，稍做離心(反應(yīng)總體

4、積為2o u 1/人份，每次反應(yīng)需要設(shè)置一個陽性對照以及一個空白對照)。轉(zhuǎn)移到檢測區(qū)，放入相應(yīng)的熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序6.3 PCR擴(kuò)增（在擴(kuò)增區(qū)操作）6.3.1打開穩(wěn)壓器電源，再打開計算機(jī)電源。6.3.2 打開擴(kuò)增儀電源，按儀器操作規(guī)程進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)條件設(shè)定。6.3.3設(shè)置四種熒光檢測通道的報告熒光、淬滅熒光;Passive Reference選擇none(見表1)ASJYK-LAB-C-P-53 第2頁，共3頁表1: 設(shè)置四種熒光檢測通道Detector NameTargetReporter DyeQuencherFAM12種高危型HPV (31, 33, 35,39, 45,

5、 51, 52, 56, 58, 5966，68)FAMnoneHEMHPV16HEX/JOEnoneROXHPV18ROX/Red 610noneCy5-globinCy5none6.3.4將循環(huán)條件設(shè)定為ProgramCyclesTemperature ()IncubationTime(min:sec)TemperatureTransitionRate(/sec)AcquisitonModeAnalysisMode119510:00min20NoneNone2459515sec20NoneNone6060secSingleQuantification31385sec20NoneNone6.

6、3.5檢查反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。6.3.6將待反應(yīng)的PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀中，并根據(jù)實(shí)際情況和儀器操作規(guī)程在程序中設(shè)定好樣孔位置。6.3.7按儀器操作規(guī)程開始循環(huán)。6.3.8擴(kuò)增結(jié)束后取出PCR反應(yīng)管，關(guān)閉擴(kuò)增儀電源，反應(yīng)管直接放入焚燒垃圾桶內(nèi)。ASJYK-LAB-C-P-52 第3頁，共3頁6.3.9分析數(shù)據(jù)，在Analysis Notes窗口中注明檢測基線值、試劑批號、陽參批號等相關(guān)信息，進(jìn)行結(jié)果分析。6.3.10關(guān)閉計算機(jī)。6.4檢驗(yàn)結(jié)果判斷：6.4.1基線，閡值的設(shè)定:基線的確定為:取3-15個循環(huán)的熒光信號:閾值設(shè)定:使閾值線超過正常陰性對照品擴(kuò)增曲線(無規(guī)則的噪

7、音線)的最高點(diǎn)，且Ct值為Under6.4.2質(zhì)控對照1陰性對照Ct值均應(yīng)顯示為Undet2陽性對照Ct值363內(nèi)對照-globin在Cy5通道Ct值40符合以上三個條件，此反應(yīng)是為有效6.4.3結(jié)果判斷1樣本在FAM、HEX、ROX通道Ct值顯示為Undet，內(nèi)對照-globin在Cy5通道Ct值40,判斷為陰性2樣本在FAM、HEX、ROX通道Ct值40, 內(nèi)對照-globin在Cy5通道Ct值40判斷為陽性 3若樣本在FAM、HEX、ROX通道40Ct值45的樣本建議重做，重做結(jié)果Ct值40者為陽性，否則為陰性7.支持性文件：7.1 高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒(PCR一熒光探針法)說明書（潮州凱普生物化學(xué)有限公司）7.2 檢測結(jié)果報告程序。