1、DNA分型技術(shù)原理、基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)(北京)有限公司，一、DNA分型的理論背景、DNA指紋或DNA分型是英國(guó)遺傳學(xué)家Alec Jeffreys在1985年首次提出的。 Jeffreys博士，STR的含義，短序列重復(fù)序列(STR )是由26bp重復(fù)單位組成的核心序列，是廣泛分布于人基因組的DNA片段，主要由核心序列拷貝數(shù)的變化產(chǎn)生長(zhǎng)度多態(tài)性。 STR是重復(fù)單位長(zhǎng)度為26的核苷酸的重復(fù)DNA序列，dinucleotide (ca ) (ca ) (ca ) tri nucleotide (gcc ) (gcc ) tetra nucleotide (aatg (AGT ACA )、STR是HGP帶來(lái)了

2、更多的STR認(rèn)知，現(xiàn)在已確定的4核苷酸的重復(fù)超過(guò)20，000個(gè)的全部基因組中的STR數(shù)可能超過(guò)100萬(wàn)！ STR占人類(lèi)基因組序列整體的3，STR的特征：1.片段短，可復(fù)合擴(kuò)增，提高識(shí)別能力。 2、多態(tài)性高，等位基因多，鑒別能力強(qiáng)。 3 .適用于舊樣品，檢驗(yàn)?zāi)芰?qiáng)。 4 .靈敏度高，有利于微量樣品的檢驗(yàn)。 5、檢測(cè)手段自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化方便，重現(xiàn)性好。DNA分型步驟、二、DNA提取、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR )技術(shù)測(cè)定臨床標(biāo)本中的病原體核酸成分，是高度敏感、最直接的檢測(cè)手段。 臨床標(biāo)本中含有蛋白質(zhì)脂質(zhì)等物質(zhì)，為了干擾PCR反應(yīng)，在進(jìn)行PCR反應(yīng)之前必須進(jìn)行核酸提取。 臨床上常見(jiàn)的標(biāo)本有血清(紙漿)、全血

3、、分泌物、棉拭子、膿液、體液、新鮮組織、殘奧翅片切片等，這些臨床標(biāo)本的處理和保存方法各不相同。 DNA提取方法、Chelex方法、Chelex是以亞氨基二乙酸為吸附因子的苯乙烯和二乙苯的共聚物，對(duì)多價(jià)金屬離子有螯合作用，防止DNA在煮沸加熱前分解，同時(shí)在高溫低離子強(qiáng)度下催化DNA釋放。 這樣能夠去除放大器中的一些抑制因素同時(shí)減少DNA的損失。 苯酚/氯仿法，原理：用苯酚-氯仿混合物提取DNA溶液中的蛋白質(zhì)系有機(jī)物質(zhì)，在水相溶液中殘留DNA。 優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用所有生物檢測(cè)材料，提取DNA分子結(jié)構(gòu)完整，特別需要RFLP、測(cè)序等大分子DNA分析技術(shù)。 磁珠法是用磁性硅膠吸附白細(xì)胞，用細(xì)胞分裂液分解細(xì)胞，從

4、細(xì)胞游離的DNA分子被吸附在磁性粒子表面，蛋白質(zhì)等分子沒(méi)有被吸附而殘留在溶液中。 磁場(chǎng)作用下磁性粒子從液體中分離，回收粒子，吸附的DNA用純水或TE洗脫。 FTA卡、FTA技術(shù)的核心是專(zhuān)利化合物，F(xiàn)TA卡預(yù)先滲透到該化合物中，血液與FTA卡接觸時(shí)細(xì)胞膜分裂，蛋白質(zhì)變性，DNA分子被捕獲并與載體牢固結(jié)合，并且FTA卡上的DNA在室溫下長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定保存，F(xiàn)TA卡在其上的硅膠膜法、硅膠膜需要在高鹽緩沖液中有效吸附核酸。 在如高鹽(例如35 mol/L鹽酸胍)那樣低ph(5.06.5)的狀態(tài)下，硅膠膜特異性地吸附DNA。 另一方面，在低鹽(TE或2.5 mmol/L Tris-HCL )或水溶液的狀態(tài)下

5、，會(huì)釋放出DNA。 理想的DNA樣品要求，1 .純度高：盡可能不污染RNA、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)。 2 .完整性好： DNA片段較大，無(wú)分解。 3. DNA濃度適當(dāng)：大多數(shù)商業(yè)STR分型試劑盒的最佳DNA濃度為1 ng左右。 三、PCR (聚合酶鏈反應(yīng))、PCR技術(shù)是體外模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞分子克隆技術(shù)。 以擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，通過(guò)一對(duì)人工合成的寡核苷酸引物，利用耐高溫DNA聚合酶的酶促作用，快速、特異地?cái)U(kuò)增特定的DNA片段。1983年，Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)、PCR的基本原理、13步驟重復(fù)2530輪，目標(biāo)DNA片段放大100萬(wàn)倍以上，DNA雙螺旋、DNA

6、單鏈和引物的恢復(fù)性、DNA復(fù)合放大的優(yōu)點(diǎn)：在一次反應(yīng)中獲得更多的信息量減少工作量，提高效率模板需求量低，在同一反應(yīng)體系中加入2對(duì)以上的引物，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增而得到的，熒光標(biāo)記的分析方法，熒光法：也被稱(chēng)為熒光PCR技術(shù)(fluoresencePCR，F(xiàn)-PCR )的熒光法是PCR的靈敏度， 融合DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)的精確定量?jī)?yōu)點(diǎn)，直接檢測(cè)計(jì)算機(jī)同步跟蹤、數(shù)據(jù)自動(dòng)化處理、PCR過(guò)程的變化得到定量結(jié)果，無(wú)需進(jìn)行PCR后處理和檢測(cè)，完全封閉操作。 熒光標(biāo)記方法的示意圖、毛細(xì)管電泳圖像、常見(jiàn)的PCR放大器、ABI公司： 9700、9600、2400 Eppendorf公司： 5331、5332、53

7、33 Bio-Rad公司： myccd有很多PCR增強(qiáng)劑，原理各不相同根據(jù)其作用和原理，大致分為1 .用于增大GC含量或形成復(fù)雜二次結(jié)構(gòu)的模板(共溶劑)(甜菜堿、二甲基亞甲基楓樹(shù)(DMSO )、甲酰胺(formamide )、甘油)2.用于保護(hù)DNA的聚合酶0.1-10的明膠)3.為了優(yōu)化引物與模板的結(jié)合(10-20mM的硫酸銨，四甲胺)4.其他增強(qiáng)劑(以pee Sanger酶法為原理，使用耐熱DNA聚合酶參照待測(cè)模板系列在這個(gè)過(guò)程中用4種不同的熒光染料標(biāo)記反應(yīng)生成物，用毛細(xì)管電泳分離反應(yīng)生成物，用固定的激光光源激發(fā)熒光信號(hào)，用CCD檢查收集數(shù)據(jù)，用計(jì)算機(jī)分析處理得到序列信息，全過(guò)程高度自動(dòng)化

8、。 四、毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電泳的原理、一束激光分成兩束，從毛細(xì)管兩側(cè)同時(shí)照射16根毛細(xì)管，DNA片段通過(guò)檢驗(yàn)室后，所有熒光染料被激發(fā)，熒光被檢測(cè)，形成橡膠圖案。檢測(cè)、ABI 310的檢測(cè)途徑圖、常用的毛細(xì)管電泳儀、五、DNA分型、電泳檢測(cè)熒光色不同的DNA片段的峰長(zhǎng)度，對(duì)應(yīng)不同的顏色。 DNA片段與內(nèi)標(biāo)相比確定長(zhǎng)度。 最后與同樣確定的等位基因Ladder進(jìn)行比較，得到未知樣品的PCR產(chǎn)物碎片分類(lèi)。 STR等位基因分類(lèi)過(guò)程、數(shù)據(jù)收集、確定峰、標(biāo)記峰、與Ladder的對(duì)比、Genotype讀取等位基因、色分離、分析人員閱讀數(shù)據(jù)、確定結(jié)果用PCR法放大得到的STR片段電泳檢測(cè)放大產(chǎn)物的長(zhǎng)度， 并與allelic ladder相