1、液相色譜基礎知識,（一）色譜起源,色譜知識,色譜法(Chromatography)：利用組分在兩相 間分配系數不同而進行分離的技術 流動相：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體 固定相：靜止不動的一相,液相色譜基礎知識,液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法 適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析,液相色譜基礎知識,液相色譜基礎知識,色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。,液相色譜流程圖

2、,輸液泵,進樣器,色譜柱,柱溫箱,檢測器,貯液瓶 （流動相）,數據處理,計算機控制系統(tǒng),島津LC2010高效液相色譜儀,島津LC2010高效液相色譜儀,一. 貯液瓶(流動相),流動相的作用: 1.攜帶樣品 2.分離樣品,采用 “HPLC” 級溶劑 避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑 對試樣有適宜的溶解度 溶劑粘度要小 與檢測器相匹配,流動相的選擇應注意,溶 劑 等 級,水的等級 純化水 蒸餾水 去離子水,波長 (nm),純化水,去離子水,因為不純物的存在，去離子水的吸光率較高,純化水中去除了無機和有機的污染物,吸光率,溶 劑 等 級,溶劑的等級 HPLC級 優(yōu)級純 分析純,都經過蒸餾和

3、0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機械顆粒,優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑,HPLC級經過0.2u的過濾,且除去有紫外吸收的雜質,微量分析、梯度洗脫,流動相的前處理,1. 過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其在使用無機鹽配制的緩沖液時 過濾膜種類: 1.水系過濾膜 2.有機系過濾膜 3.混合系,流動相的前處理,2.脫氣(用超聲波) 目的：除去流動相中因溶解或混合而產生的氣泡 氣泡產生原因：溫度上升 、 壓力下降 、 溶劑混合 3.貯存： 應貯存于玻璃容器中。不能貯存在塑料容器中。 因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增

4、塑劑，導致溶劑受污染。,液相色譜流程圖,輸液泵,進樣器,色譜柱,柱溫箱,檢測器,貯液瓶 （流動相）,數據處理,計算機控制系統(tǒng),二.輸液泵,作用:高壓輸送流動相. 種類：恒壓泵 恒流泵 恒流泵按結構又可分為： 1.螺旋注射泵 2.柱塞往復泵 3.隔膜往復泵,輸液泵柱塞往復泵,泵的維護,1.防止固體微粒進入泵體。(流動相嚴格過濾) 2.防腐蝕.(流動相不應含有任何腐蝕性物質) 3.防空泵運轉.(泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產生漏液) 4.防壓力過高.(輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產生漏液。) 5.防氣泡

5、.流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。,液相色譜流程圖,輸液泵,進樣器,色譜柱,柱溫箱,檢測器,貯液瓶 （流動相）,數據處理,計算機控制系統(tǒng),三.進樣器,自動進樣器 手動進樣器 自動進樣的特點： 1、超高的進樣精度 2、超快的進樣速度 3、可以進行批進樣,液相色譜流程圖,輸液泵,進樣器,色譜柱,柱溫箱,檢測器,貯液瓶 （流動相）,數據處理,計算機控制系統(tǒng),四.色譜柱,作用:分離樣品 分離原理: 1.液固色譜法 2.液液色譜法 (正相和反相) 3.離子交換色譜法 4.離子對色譜法 5.排阻色譜法,四.色譜柱,填料: 多孔硅膠以及以硅膠為基質的

6、鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等 填料粒度: 一般為3,5,7,10m 內徑: 2-5mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm） 柱長: 10-30cm,四.色譜柱,柱的發(fā)展方向： 更短,柱長3-10cm 填料顆粒更小,粒徑2-3m,色譜柱的使用注意點,1）避免柱壓過高（根據不同的柱子要求不同） 2）柱溫在40左右,一般不超過50 3）一般ODS柱流動相PH使用范圍為27.5 4) 流動相有機溶劑比例過低, 柱效下降快 5）避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。 6）應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?色譜柱的使用

7、注意點,7）樣品進樣前必須經過微孔膜過濾 8）經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。如果用緩沖溶液作為流動相，分析結束時必須先用純水沖洗10分鐘，再用甲醇-水沖洗，絕不能讓緩沖溶夜留在柱子中過夜。 9）使用保護柱可延長柱子壽命。保護柱應經常更換。,柱溫箱,柱溫控制的優(yōu)點：,1、控制溫度，保證分析結果重現(xiàn)性 2、升高溫度，降低了流動相的黏度，降低柱壓，保證色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。,液相色譜流程圖,輸液泵,進樣器,色譜柱,柱溫箱,檢測器,貯液瓶 （流動相）,數據處理,計算機控制系統(tǒng),五.檢測器,檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分定量轉變?yōu)殡娦盘枴?HPLC的檢測器要求：

8、 靈敏度高 噪音低（對溫度、流量等外界變化不敏感） 線性范圍寬 重復性好 適用范圍廣,紫外可見檢測器（UV/VIS） 二極管陣列檢測器（PDA） 示差檢測器（RID） 電導檢測器（CDD） 熒光檢測器（RF） 電化學檢測器（L-ECD） 質譜檢測器（MS） 蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）,常用檢測器,紫外可見檢測器,原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收 優(yōu)點：1）對溫度和流速變化不敏感 2）可用于梯度分析 缺點：僅適用于測定有紫外吸收的物質,紫外可見檢測器,紫外可見檢測器,示差折光檢測器,原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率變化以測定 試樣各組分濃度。 優(yōu)點：通用型檢測器 缺點：1）對溫

9、度和壓力變化敏感 2）不能用于梯度分析,原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強度進行檢測 優(yōu)點： 1）靈敏度極高，是最靈敏的檢測器之一 2）選擇性好 3）對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫 缺點：僅適用于測定可產生熒光的物質,熒光檢測器,液相色譜流程圖,輸液泵,進樣器,色譜柱,柱溫箱,檢測器,溶劑,數據處理,計算機控制系統(tǒng),六.數據處理和計算機控制系統(tǒng),計算機控制系統(tǒng)的作用： 采集信號、分析數據； 控制色譜儀,基本概念和術語,1、色譜圖(chromatogram)樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線。 2、基線(base line)經流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流

10、出曲線。一般應平行于時間軸。 3、漂移(drift)基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。,基本概念和術語,4、色譜峰(peak)組分流經檢測器時響應的連續(xù)信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分 5、峰面積(peak area，A)峰與峰底所包圍的面積 6、保留時間(retention time，tR)從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。,數據處理,1.定性：保留時間 2.定量方法： 內標法 外標法 面積歸一法,糖的色譜圖,Analytical Conditions Column : Shim-

11、pack CLC-NH2 Mobile phase : Acetonitrile / water = 7 / 3 Flow rate : 1.0 mL/min Temperature : Ambient Peaks 1. 甘油 2. 木糖 3. 果糖 4. 葡萄糖 5. 蔗糖 6. 甘露糖 7. 乳糖,數據處理,標準曲線的制作: 曲線點數：一點、兩點及多點 曲線計算：線性范圍、線性回歸、折線、 二次曲線、三次曲線,外標法,公式：,優(yōu)點： 1）不需所有峰都流出或被檢測到 2）只對所測組分作校正 缺點： 1）進樣量必須準確 2）儀器必須有良好的穩(wěn)定性,Ai,Ci,Ci=FiAi,面積歸一化法,公式

12、：,優(yōu)點： 1）無需做校正，簡便，快速 2）進樣量不嚴格要求,缺點： 1）所有組分都流出且被檢測到 2）所有組分的檢測靈敏度都相同,內標法,公式：,優(yōu)點： 1）進樣量不嚴格要求 2）只對所測組分作校正 3）減少前處理影響 缺點： 1）必須在樣品中加一內標組分 2）操作較為繁瑣 3）選擇內標物困難,Ai/Ais,Ci/Cis,液相色譜流程圖,輸液泵,進樣器,色譜柱,柱溫箱,檢測器,溶劑,數據處理,計算機控制系統(tǒng),維生素B族含量的測定,一、色譜條件： 檢測器：紫外檢測器 色譜柱：ODS 150mm4.6mm 粒度5.0m 流動相：甲醇-已烷磺酸鈉溶液 30:70 波長：280nm 流速：0.8ml/min 柱溫: 30,維生素B族含量的測定,二.所需主要儀器、試劑和耗材 1.儀器：島津LC2010AH液相色譜儀、真空泵、超聲波清洗機、抽濾裝置、離心機等 2.試劑：甲醇（色譜級）、超純水、己烷磺酸鈉、二乙胺、磷酸、維生素B1及B6標準品 3.耗材： 0.45um有機系微孔濾膜、無機系針孔濾膜,維生素B族含量的測定,三、操作步驟： 1.流動相前處理：脫氣 過濾 2.打開液相色譜儀及計算機，打開液相色譜儀控制軟件 3.設定所需的色譜條件，并下載到色譜儀，運行，等待基線平衡（一般需要30min以上）,維生素B族含量的測定,4.樣品前處理：