1、2.生物大分子的制備，2.1概述自然科學(xué)，特別是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，對(duì)蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能的研究是探索生命奧秘的中心課題，對(duì)生物大分子幾何及功能的研究首先要解決生物大分子的制備問(wèn)題，但是生物大分子的分離純化和制備是非常細(xì)致而困難的工作。與化學(xué)產(chǎn)品的分離準(zhǔn)備相比，生物大分子的制備具有以下主要特征：生物材料的組成非常復(fù)雜，經(jīng)常包含數(shù)百或數(shù)千種化合物。很多生物大分子的生物材料含量很低，分離純化的程序很多種多樣，過(guò)程很長(zhǎng)。許多生物大分子一旦離開(kāi)生物體內(nèi)的環(huán)境就很容易著火，所以分離過(guò)程中如何防止滅活是生物大分子提取制備的最困難的部分。生物大分子的制備幾乎在溶液中完成，很難準(zhǔn)確估計(jì)

2、和判斷溫度、pH值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種成分的復(fù)合影響。生物大分子的制造通常可以按照以下步驟進(jìn)行：要準(zhǔn)備的生物大分子的目的和要求，決定是科學(xué)研究、開(kāi)發(fā)，還是發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)。建立相應(yīng)的可靠的分析測(cè)量方法是準(zhǔn)備生物大分子的關(guān)鍵。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)查和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)。生物材料的粉碎和預(yù)處理。分離純化方案的選擇和探索是最困難的過(guò)程。生物大分子制備物的均勻性(即純度)的鑒定，一維傳記靈動(dòng)的屬相，二維傳記靈動(dòng)的一點(diǎn)，或者HPLC和毛細(xì)管傳記靈動(dòng)都應(yīng)該成為最高峰。產(chǎn)品的濃縮、干燥和保存。分析測(cè)量方法主要有生物學(xué)、物理、化學(xué)兩種茄子。生物學(xué)的測(cè)定方法主要包括酶的各種測(cè)定方法、蛋

3、白質(zhì)含量的各種測(cè)定方法、免疫化學(xué)法、放射性同位素示蹤法等。物理、化學(xué)方法主要包括比色法、氣相色譜法、液相色譜法、頻譜(紫外線、紅外、熒光等分光光度法)、電泳法、核磁共振等。在實(shí)際工作中，盡可能多地使用儀器分析方法，使分析測(cè)量更快、更容易。需要知道的生物大分子的物理，化學(xué)性質(zhì)：水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性。生物大分子在各種溫度、pH值和各種緩沖液中的穩(wěn)定性。固體時(shí)溫度、含水量及董潔干燥時(shí)的穩(wěn)定性。各種物理性質(zhì)：分子的大小、穿膜的能力、電流動(dòng)的情況、電場(chǎng)中的行為、離心沉積的表現(xiàn)、各種凝膠、裴秀智等填充物中的分配系數(shù)。其他化學(xué)性質(zhì)：各種蛋白質(zhì)酶，水解酶的穩(wěn)定性，各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性等。對(duì)其他生物分子的

4、特殊親和力。準(zhǔn)備生物大分子的分離純化方法多種多樣。主要利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解性、極性、電荷、與其他分子的親和性等。各種方法的基本原理可以概括為兩個(gè)茄子方面。利用混合物各組成部分分布系數(shù)的差異，可以分配到鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、層分析、結(jié)晶等兩個(gè)以上階段。將混合物放在物相(大部分是液體)上，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用，將各組分布在不同的區(qū)域，實(shí)現(xiàn)傳記電泳、離心、超濾等分離目的。目前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的核心技術(shù)是傳記游泳、分層分析、高速和超速離心。2.2根據(jù)生物大分子準(zhǔn)備的預(yù)處理2.2.1生物材料的選擇準(zhǔn)備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳锊牧稀２牧系膩?lái)源只是動(dòng)物

5、、植物、微生物及其代謝產(chǎn)物。所選材料含量高，來(lái)源豐富，準(zhǔn)備工藝簡(jiǎn)單，成本低，要盡量保持新鮮感，盡快加工處理。動(dòng)物組織首先要去除結(jié)締組織、脂肪等不活動(dòng)部分，粉碎后從適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛。绻璧某煞衷诩?xì)胞內(nèi)，則首先要粉碎細(xì)胞。植物必須先剝皮，去除脂肪。微生物材料要及時(shí)分離菌體和發(fā)酵液。生物材料如果暫時(shí)不提取，就要冷凍保存。動(dòng)物材料需要深凍保存。2.2.2細(xì)胞的其他生物體或同一生物體其他部位破碎的組織，細(xì)胞容易破碎，使用的方法也不同。例如，動(dòng)物器官的細(xì)胞膜比較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于比較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素構(gòu)成的細(xì)胞壁，必須采用專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞粉碎方法。(1)機(jī)械法：1)研磨：將切碎的動(dòng)物組織放

6、入蓮腳或勻漿機(jī)中，少量放入石英砂拋光或均質(zhì)化。2)組織搗碎：這是比較激烈的打破細(xì)胞的方法，通常用家用食品加工機(jī)打碎組織，然后用1000r/min 20000 r/min的內(nèi)刀組織搗碎機(jī)(即高速分散劑)打碎組織的細(xì)胞。(2)物理方法：1)將壞死細(xì)胞冷卻到15到20，然后室溫(或40) 2)超聲波處理方法：牙齒方法是利用超聲波的振動(dòng)力粉碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。打破微生物細(xì)菌和酵母菌需要更多的時(shí)間。3)擠壓法：這是溫和完全打破細(xì)胞的方法。在1000105Pa2000105Pa的高壓下，通過(guò)小孔突然向大氣壓力釋放細(xì)胞顯液，細(xì)胞就完全破裂了。4)冷熱交替法：可以從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸。保持90多分鐘，

7、然后立即放入冰浴冷卻，這樣重復(fù)多次，大部分細(xì)胞都會(huì)破碎。(3)化學(xué)和生物化學(xué)方法：1)自溶方法：將新鮮生物物質(zhì)保存在一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，在自己擁有的各種水解酶(如蛋白酶和酯酶等)的作用下細(xì)胞結(jié)構(gòu)溶解，釋放細(xì)胞內(nèi)容物。2)溶脹法：細(xì)胞膜是天然半透膜、低滲透溶液和低濃度稀鹽溶液中的滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞膜膨脹，釋放細(xì)胞內(nèi)容物。3)酶解法：利用溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、酯酶等多種水解酶，可以專(zhuān)業(yè)分解細(xì)胞壁37，pH8至15分鐘。4)有機(jī)溶劑處理方法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或十二烷基硫酸鈉(SDS)等表面活性劑處理細(xì)胞，溶解細(xì)胞膜，使細(xì)胞破裂，牙齒方法也可與研磨方法結(jié)合

8、使用。2.2.3生物大分子的提取“提取”是在分離純化前字典處理或把破碎的細(xì)胞放入溶劑中，使分離的生物大分子充分釋放到溶劑中的過(guò)程。影響萃取的因素主要是目的產(chǎn)物在萃取溶劑中溶解的大小，固體向液體擴(kuò)散的困難；溶劑的pH值和提取時(shí)間等。普通：極性物質(zhì)容易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑。堿性物質(zhì)能很好地溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)能很好地溶于堿性溶劑。溫度升高，溶解度增加。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。提取時(shí)選擇的條件應(yīng)有助于維持目的產(chǎn)品溶解度的增加及其生物活性。水溶液萃?。旱鞍踪|(zhì)和酶的萃取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解性大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。用水溶液提取

9、生物大分子時(shí)需要注意的幾個(gè)茄子主要影響因素是1)鹽濃度(即離子強(qiáng)度)。離子強(qiáng)度對(duì)生物大分子的溶解度有很大影響，某些物質(zhì)(如DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物)在高離子強(qiáng)度下的溶解度增加。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶在低離子強(qiáng)度的溶液中具有很大的溶解度。例如，在純凈水中添加少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比純凈水大幅度增加，這稱為“鹽溶解”現(xiàn)象。溶鹽現(xiàn)象的發(fā)生主要是少量離子活動(dòng)，減少偶極分子間極性基團(tuán)的靜電吸力，增加溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。有時(shí)為了提高提取效率，需要降低或提高溶劑的極性。在水溶液中加入蔗糖或甘油會(huì)降低極性，增加離子強(qiáng)度(例如，KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4相加)會(huì)增加溶液的極性。2

10、) pH值：蛋白質(zhì)、酶和核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值相關(guān)。應(yīng)盡量避免過(guò)氧和過(guò)堿，一般在pH=68范圍內(nèi)提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)兩側(cè)。3)溫度：為防止變性和分解，準(zhǔn)備活性蛋白和酶。萃取時(shí)通常在05的低溫下工作。4)防止蛋白酶或核酸酶的分解作用。通過(guò)加入抑制劑或調(diào)整提取液的pH、離子強(qiáng)度、極性等的方法，激活相應(yīng)的水解酶，阻止對(duì)想要凈化的蛋白質(zhì)、酶、核酸的分解作用。5)攪拌和氧化：攪拌可以促進(jìn)提取物的溶解，一般溫和攪拌為宜，速度過(guò)快容易產(chǎn)生大量泡沫，與空氣的接觸面增加，會(huì)引起酶等物質(zhì)的變性停用。一般蛋白質(zhì)中含有相當(dāng)數(shù)量的巰基，因此某些巰基往往是活性部位的必需組，如

11、果提取物中有氧化劑或與空氣中的氧接觸過(guò)多，巰基就會(huì)因分子內(nèi)或分子間的二硫結(jié)合而氧化，從而失去酶活性。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸，防止巰基氧化。有機(jī)溶劑與脂肪比較堅(jiān)固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難以溶于水、稀鹽、稀酸、稀堿，經(jīng)常提取徐璐不同比例的有機(jī)溶劑。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，牙齒溶劑可與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親水性。一些蛋白質(zhì)和酶可溶解在含有稀酸、稀堿、一定比例有機(jī)溶劑的水溶液中，在牙齒情況下，利用稀有機(jī)溶液提取往往有助于防止水解酶破壞，消除雜質(zhì)，提高純化效果。例如胰島素。2.3生物大分子的分離純化，因?yàn)樯矬w的組成成分太復(fù)雜，數(shù)千種或數(shù)萬(wàn)種

12、生物分子在同一體系中，所以不可能有適合各種分子的固定分離程序，但分離大部分分離工作核心部分的基本手段是相同的。(阿爾伯特愛(ài)因斯坦，美國(guó)電視電視劇，動(dòng)物名言)要避免盲目性，節(jié)約實(shí)驗(yàn)探索時(shí)間，要認(rèn)真參考前人的經(jīng)驗(yàn)，減少迂回。常用的分離純化方法及技術(shù)包括沉淀法(包括鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀等)、離心、吸附層分析、凝膠過(guò)濾層、離子交換層分析、親和層分析、快速準(zhǔn)備型液相色譜法頻譜、傳記集中劑傳記游泳等。牙齒章節(jié)以介紹沉淀法為主。2.3.1沉淀沉淀沉淀是溶液中溶質(zhì)從液相變成固相析出的過(guò)程。沉淀法(即溶出法)操作簡(jiǎn)單，成本低，不僅用于實(shí)驗(yàn)室，還用于特定生產(chǎn)目的的制備過(guò)程，特別是在準(zhǔn)備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用

13、的方法分離和純化生物大分子。通過(guò)沉淀將目的生物的大分子轉(zhuǎn)移到固相沉淀中，或留在液體中，與雜質(zhì)初步分離。其基本原理是根據(jù)溶劑中其他物質(zhì)的溶解度達(dá)到分離的目的。徐璐不同溶解度的發(fā)生是溶質(zhì)分子與溶質(zhì)和溶劑分子間親和力的差異引起的。與溶解度的大小、溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)。溶劑成分的變化或添加特定的沉淀劑，溶液的pH值、離子強(qiáng)度、極性的變化都顯著地改變?nèi)苜|(zhì)的溶解度。生物大分子制造中最常用的幾種茄子沉淀方法是中性鹽沉淀(鹽析法)。多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。有機(jī)溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸、生物小分子的分離純化。選擇性沉淀(熱變性沉淀和酸堿變性沉淀):主要用于從特定耐熱性和特定pH值

14、中去除變性。等電點(diǎn)沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)和其他兩性物質(zhì)的沉淀，但牙齒方法單獨(dú)應(yīng)用少，與其他方法一起使用。有機(jī)聚合物沉淀：以PEG聚乙二醇(Polyethyene glycol)為沉淀劑的快速發(fā)展新方法。2.3.1.1中性鹽沉淀(鹽析法)溶液中加入中性鹽沉淀生物大分子的過(guò)程稱為“鹽析”。除蛋白質(zhì)和酶外，多肽、多糖、核酸等都可以用鹽析法沉淀分離。鹽析法牙齒最廣泛應(yīng)用的是蛋白質(zhì)領(lǐng)域已有80多年歷史的歷史，其突出優(yōu)點(diǎn)是成本牙齒低，不需要特別昂貴的設(shè)備。操作簡(jiǎn)單，安全。對(duì)很多生物活性物質(zhì)有穩(wěn)定作用。中性鹽沉淀蛋白的基本原理蛋白質(zhì)和酶都容易溶于水。因?yàn)檠例X分子的COOH，NH2，OH都是親水基團(tuán)。牙齒基

15、團(tuán)與極性水分子相互作用，形成水合層，圍繞在蛋白質(zhì)分子周?chē)纬?nm100nm的親水膠體，削弱蛋白質(zhì)分子之間的作用力。蛋白質(zhì)分子表面的極性基團(tuán)越多，水合層就越厚，蛋白質(zhì)分子就越厚，親水膠體在水中有兩個(gè)穩(wěn)定的茄子因素：電荷和水膜。中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)和酶分子的親水性大小，因此添加了大量的中性鹽，然后搶走水分子，破壞水膜，暴露疏水區(qū)域，同時(shí)中和電荷，使親水膠體破壞，蛋白質(zhì)分子形成沉淀。鹽析圖見(jiàn)下頁(yè)“圖4”。在常用中性鹽選擇中，最重要的是(NH4)2SO4。這是因?yàn)樗绕渌胀}類(lèi)有更好的優(yōu)點(diǎn)。1)溶解度很大。特別是在低溫下，仍有相當(dāng)高的溶解度。這在其他鹽類(lèi)中是找不到的。酶和各種蛋白質(zhì)通常在低溫下穩(wěn)

16、定，因此鹽析工作也要在低溫下進(jìn)行(04)。如下表所示，硫銨的零點(diǎn)溶解度比其他鹽類(lèi)高得多。表2-1多種茄子鹽在不同溫度下的溶解度(克/100毫升水)0 20 80 100(NH4)2 so 4 70 . 6 75 . 4 95 . 3 95 . 3 103 Na2 so 4 . 9 18 . 9 43 . 3 44 3)變性不易誘發(fā)，具有酶和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定效果。有些酶或蛋白質(zhì)的濃度為23mol/L(NH4)2 so 4，保存了幾年。4)低成本價(jià)錢(qián)，廢液不污染環(huán)境。鹽析操作方法最常用的是固體硫酸銨添加法。用細(xì)粉研磨，慢慢均勻地放多次，接近計(jì)劃飽和度時(shí)，加鹽的速度更慢，局部硫酸銨濃度太高，盡量避免不需要的蛋白質(zhì)沉淀。(阿爾伯特愛(ài)因斯坦，Northern Exposure(美國(guó)電視電視劇)，在鹽析后，要在冰浴中留一段時(shí)間，等沉淀完成后再進(jìn)行離心和過(guò)濾。低濃度硫酸銨中，鹽析可以離心，高濃度硫酸銨常用過(guò)濾方法。各種飽和度需要添加固體硫酸銨的量可在附錄中找到。鹽析曲線的制作如果想分離新的蛋白質(zhì)和酶，沒(méi)有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)供參考，首先要確定沉淀牙齒物質(zhì)的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下(講義p39):蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)或酶活性10 20 30 40 50 60 70 80 90 100硫酸銨飽和，低濃度蛋