1、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理、操作和應(yīng)用，黃逸煒，湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室，什么是聚合酶鏈反應(yīng)，聚合酶鏈反應(yīng)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來的一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的發(fā)展歷史。關(guān)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的文章首先由美國(guó)科學(xué)家凱利穆利斯等人在科學(xué)雜志上發(fā)表，報(bào)道了耐熱DNA聚合酶Taq(一種從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌中提取的耐熱DNA聚合酶)的發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著分子時(shí)代的到來。12月，科學(xué)雜志將它所用的聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”。1993年，凱利穆利斯因發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)原理1。遺傳物質(zhì)：核染色體DNA(由脫氧核糖核酸、磷

2、酸鏈和堿基組成)的堿基(A、T、C、G)排列成雙鏈螺旋，堿基序列的長(zhǎng)度和排列順序決定了生物的多樣性。例如，人類體細(xì)胞中有31億個(gè)堿基對(duì)。根據(jù)上述0.1%的差異，人與人之間有300萬個(gè)堿基對(duì)的差異。聚合酶鏈反應(yīng)的基本工作原理是用待擴(kuò)增的脫氧核糖核酸分子作為模板，用一對(duì)與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段作為引物。在脫氧核糖核酸聚合酶的作用下，它按照半保守復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸，直到新的脫氧核糖核酸合成完成。聚合酶鏈反應(yīng)的基本組分包括七個(gè)基本組分：模板脫氧核糖核酸、特異性引物、熱穩(wěn)定脫氧核糖核酸聚合酶、脫氧核苷三磷酸、二價(jià)陽離子、緩沖溶液和一價(jià)陽離子?；镜姆磻?yīng)步驟是變性-退火-延伸。最后，脫氧核糖核酸用電

3、子束等染料染色，然后用紫外線燈檢測(cè)。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)原理3、重復(fù)13個(gè)步驟和2535輪，靶基因片段擴(kuò)增100多萬次，脫氧核糖核酸雙螺旋、脫氧核糖核酸單鏈和引物復(fù)性，脫氧核糖核酸變性形成兩條單鏈，亞鏈延伸的脫氧核糖核酸加倍。與聚合酶鏈反應(yīng)相比，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的原理在初始階段增加了步驟：核糖核酸合成，這是一個(gè)從單鏈到雙鏈的過程。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)原理1。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)是指在聚合酶鏈反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)過程，最后用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板的方法。常用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑：SYBR Green I Taqman水解探針，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈

4、反應(yīng)原理2?；€是指在聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)的最初幾個(gè)循環(huán)中，熒光信號(hào)變化很小，并接近一條直線，這條直線就是基線。光閾值的設(shè)定一般以前15輪聚合酶鏈反應(yīng)的熒光信號(hào)作為熒光背景信號(hào)，熒光閾值為3-15輪聚合酶鏈反應(yīng)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光閾值設(shè)定在聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的指數(shù)周期內(nèi)。循環(huán)閾值表示當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，每個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)管經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的CT值與模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。初始拷貝數(shù)越多，聯(lián)系類型值越小，反之亦然。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以通過使用具有已知初始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)來制作，其中橫坐標(biāo)表示初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)表示CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，就可以從標(biāo)準(zhǔn)

5、曲線計(jì)算出樣品的初始拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)原理3。循環(huán)數(shù)固定后，熒光信號(hào)與模板數(shù)的比例越大，熒光達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)(Ct值)就越少。初始模板的對(duì)數(shù)濃度與CT呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值可以計(jì)算出樣品中模板的含量。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，優(yōu)勢(shì)：是具體的，敏感的，快速，簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化等。由于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的局限性，為了構(gòu)建特異性引物和選擇性擴(kuò)增特異性的脫氧核糖核酸序列，操作時(shí)避免使用氣霧劑，特別注意陽性樣品的處理，使用一次性耗材，戴手套并經(jīng)常更換，在最后一步總是添加核酸，并單獨(dú)使用液體。引物設(shè)計(jì)合理，Taq酶擴(kuò)增的錯(cuò)誤率高，鎂離子濃度約為1/100堿基對(duì)/20次循環(huán)對(duì)反應(yīng)效率的影響

6、，如儀器穩(wěn)定性、升溫和降溫速率、管道密封性等。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)注重防止核糖核酸降解，以及聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的操作1 .以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)流感病毒為例，說明聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的操作步驟。主要儀器包括聚合酶鏈反應(yīng)儀、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)儀、微量移液器、高速冷凍離心機(jī)、電泳儀和電泳槽、凝膠電泳觀察儀或成像系統(tǒng)、生物安全柜等。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的操作2，1。病毒核酸的核糖核酸提取。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)或?qū)崟r(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)3。紫外燈檢測(cè)或直接在計(jì)算機(jī)上讀取結(jié)果，流感病毒核酸提取1，檢測(cè)材料QIAGEN公司的Rneasy微型試劑盒(或QIAGEN公司的QIAmp病毒核糖核酸微型試劑

7、盒，具有類似的操作)-巰基乙醇70%乙醇無菌和脫氧核糖核酸，Rnase 1.5ml毫升離心管10l，20l，200l，1000l取樣器和13K可調(diào)槍頭微型冷凍離心機(jī)，200l待檢測(cè)流感病毒，流感病毒核酸提取2，1。取200微升采樣溶液(鼻拭子、咽拭子、胸腔積液等)。)或病毒培養(yǎng)物(雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液)，并將其放入1.5毫升Eppendorf試管中。2.依次加入350微升rlt溶液、3.5微升巰基乙醇和550微升70%乙醇，混合均勻。3.將Rneasy微型旋轉(zhuǎn)柱放在干凈的2ml收集管上。從步驟2中吸出600微升混合溶液并將其加入柱中，以12，000轉(zhuǎn)/分的速度離心15秒鐘，將離心液4丟棄在收

8、集管中，將柱放回收集管中，將步驟2中剩余的混合溶液吸到柱中，以12，000轉(zhuǎn)/分的速度離心15秒鐘，丟棄離心液5，并以12，000轉(zhuǎn)/分的速度將700微升洗滌緩沖液RW1溶液加入柱中。離心15秒6。取一個(gè)干凈的2ml收集管，將離心后的色譜柱移到新的收集管中，以12000轉(zhuǎn)/分的速度向色譜柱中加入500微升洗滌緩沖液，離心15秒7。丟棄收集管中的離心溶液，然后以13，000-14，000轉(zhuǎn)/分的速度向色譜柱中加入500微升洗滌緩沖液。離心2分鐘。8.將色譜柱移至一個(gè)干凈的1.5毫升eppendrof試管中，加入20-50微升不含RNAse的水，在室溫下放置1-3分鐘，轉(zhuǎn)速為9，12，000轉(zhuǎn)/分

9、，離心1分鐘，收集離心液作為提取的病毒Rna。立即進(jìn)行試驗(yàn)，或?qū)⑻准４嬖?20以下，作為QIAGEN公司的RNAYS迷你套件(目錄#74104)。注意：在試劑盒中使用視網(wǎng)膜色素上皮溶液之前，應(yīng)加入44毫升無水乙醇，使最終體積達(dá)到55毫升。用于擴(kuò)增H5亞型禽流感病毒的引物序列為：H5-1: 5-gcc att CCA CAA cat ACA CCC-3，H5-: 5-CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG-3，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)2，1，分別標(biāo)記0.2毫升在每個(gè)試管中加入以下內(nèi)容：5ul QIAGEN OneStep RT-PCR緩沖液，5 1ul 10mm dntps1ul酶混合

10、物0.13 ul RNase抑制劑(40u/ul) 14.3 ul無RNase水2，加入1 ul引物和5ul未知RNA或5 ul陽性對(duì)照或無Rnase水作為陰性對(duì)照。一步逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)條件如下：50分鐘30分鐘(逆轉(zhuǎn)錄：核糖核酸)，95分鐘15分鐘(逆轉(zhuǎn)錄酶失活等)。94變性30秒55退火30秒72延伸30秒回到步驟3，34循環(huán)72 2分鐘，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)1，凝膠電泳緩沖液配方10TBE緩沖液(每升):tris 107.8克硼酸55.0克乙二胺四乙酸(Na2) 8.2克10 tae緩沖液(每升):Tris48.4g克冰醋酸11.42克0.5摩爾/升乙二胺四乙酸20毫升1.5

11、%瓊脂糖凝膠用電泳緩沖液制備，和88在100伏下電泳30分鐘，紫外線觀察和照片記錄。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)2、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及結(jié)果判斷、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)操作1、病毒核酸核糖核酸提?。号c逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)相同實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)：以皮吉公司禽流感檢測(cè)試劑盒為例，根據(jù)試劑盒操作說明，25l反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)溶液15l、Taq酶0.25l、N/4逆轉(zhuǎn)錄酶(N為聚合酶鏈反應(yīng)管數(shù))、10L待測(cè)核糖核酸、添加核糖核酸后400g反應(yīng)條件為：4230分鐘；923分鐘；9210秒、4530秒和721分鐘的5次循環(huán)；92 10秒，60 30秒40 40周期，60點(diǎn)鐘設(shè)置收

12、集熒光。實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)操作2，設(shè)置結(jié)果分析條件，讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則是閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示為陰性；或者可以根據(jù)儀器的噪音進(jìn)行調(diào)整。循環(huán)閾值表示當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，每個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)管經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的CT值與模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。初始拷貝數(shù)越多，聯(lián)系類型值越小，反之亦然。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以通過使用具有已知初始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)來制作，其中橫坐標(biāo)表示初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)表示CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的初始拷貝數(shù)?；€是指在聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)的最初幾個(gè)循環(huán)中，熒光信號(hào)變化很小，并接近

13、一條直線，這條直線就是基線。光閾值的設(shè)定一般以前15輪聚合酶鏈反應(yīng)的熒光信號(hào)作為熒光背景信號(hào)，熒光閾值為3-15輪聚合酶鏈反應(yīng)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光閾值設(shè)定在聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的指數(shù)周期內(nèi)。實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)操作3，結(jié)果判斷1，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)1.1，陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為陰性。1.2陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于或等于28.0。否則，這個(gè)實(shí)驗(yàn)將被視為無效。2.結(jié)果無CT值的2.1例為陰性。2.2值為30.0的樣本為陽性。2.3Ct值大于30.0的樣品建議重做。如果重做結(jié)果中沒有值，它將為負(fù)，否則為正。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、法醫(yī)個(gè)體鑒定和親子鑒定等基因克隆、測(cè)序和表達(dá)、遺傳病檢測(cè)、腫瘤診斷、病原體檢測(cè)、基

14、因克隆和表達(dá)、DNA指紋技術(shù)1。1984年，英國(guó)遺傳學(xué)家亞歷克杰弗里斯在研究肌紅蛋白的脫氧核糖核酸序列時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)一小段脫氧核糖核酸在無功能的脫氧核糖核酸(不產(chǎn)生蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸)上重復(fù)。這個(gè)包含約15個(gè)堿基的DNA片段在不同個(gè)體間重復(fù)的頻率和位置有明顯的差異。杰弗里斯首先研究了自己的基因，并驗(yàn)證了這項(xiàng)技術(shù)。如果我們有血緣關(guān)系，這些差異就會(huì)大大減少。杰弗里斯將這項(xiàng)技術(shù)命名為DNA指紋技術(shù)。DNA指紋技術(shù)2，采集血樣(毛發(fā)、精液、口腔粘膜細(xì)胞)，分離DNA，通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增所選DNA片段，比較它們，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，我們可以得到它是否是兇手或是否與血液有關(guān)。分子診斷學(xué)以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)

15、，運(yùn)用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法，研究人類內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子系統(tǒng)的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療和預(yù)后提供信息和決策依據(jù)。在分子診斷學(xué)的發(fā)展階段，分子診斷學(xué)經(jīng)歷了三個(gè)階段：(1)通過DNA分子雜交對(duì)遺傳病進(jìn)行遺傳診斷；(2)基于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的脫氧核糖核酸診斷，特別是定量聚合酶鏈反應(yīng)和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)的應(yīng)用，不僅可以檢測(cè)宿主體內(nèi)存在的各種脫氧核糖核酸和核糖核酸病原體的載量，還可以檢測(cè)多基因遺傳病細(xì)胞中的基因表達(dá)。(3)以生物芯片技術(shù)為代表的高通量密集檢測(cè)技術(shù)分子診斷的發(fā)展方向：(1)分子診斷的內(nèi)容已經(jīng)從傳統(tǒng)的脫氧核糖核酸診斷發(fā)展到對(duì)核酸及其表達(dá)產(chǎn)物(基因和蛋白質(zhì))的綜合診斷；(2)分子診斷策略已經(jīng)從分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)等單一技術(shù)的診斷發(fā)展到多種技術(shù)有機(jī)結(jié)