1、第十一章 食品中維生素的測定,Determination of Vitamin in Food,一、概述 二、脂溶性維生素的測定（重點、難點） 三、水溶性維生素的測定（重點、難點）,1,一、概述,（一）維生素的分類及共性 （二）常見維生素的生理功能 （三） 維生素的測定意義,2,（一）維生素的分類 目前已發(fā)現(xiàn)的維生素約有二、三十種，按溶解性可分為兩大類： 脂溶性維生素：A、D、E、K等； 水溶性維生素：B、C等（如B1、B2、B6、B12和C等）,3,維生素都具有以下共同特點： 這些化合物或其前體化合物都在天然食物中存在； 它們不能供給機體熱能；也不是構成組織的基本原料； 主要功用是通過作為輔

2、酶的成份調節(jié)代謝過程，需要量 極??； 它們一般在體內不能合成，或合成量不能滿足生理需要，必須經常從食物中攝取； 長期缺乏任何一種維生素都會導致相應的疾病。,4,維生素A：是人體必需營養(yǎng)素，能促進人體發(fā)育，防止眼膜 炎、夜盲癥等疾病。 維生素B1：也叫硫胺素，對人體的功能主要是防腳氣病、神經 炎，幫助消化，促進發(fā)育。 維生素B2：對人體功能防口角炎、皮膚炎，防止怕光現(xiàn)象。 維生素C：防壞血病，促進外傷愈合，使機體增強抵抗力。 維生素D：調節(jié)體內礦物鹽的平衡，特別是對人體內鈣、磷的 代謝，并能防止軟骨病。,（二）常見維生素的生理功能,5,（三）維生素的測定意義 評價食品的營養(yǎng)價值； 開發(fā)利用富含維

3、生素的食品資源； 指導人們合理調整膳食結構，防止維生素缺乏癥； 研究維生素在食品加工、貯存等過程中的穩(wěn)定性，指導制定合理的生產工藝條件及貯存條件，最大限度地保留各種維生素； 監(jiān)督維生素強化食品的強化劑量，防止維生素攝入過多引起中毒。,6,二、脂溶性維生素的測定 脂溶性維生素的理化性質 脂溶性維生素的測定方法,7,常與脂類物質共存于食物中，攝食時一道被人體吸收。 1.溶解性： 不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機溶劑； 2.耐酸堿性： 維生素A、D對酸不穩(wěn)定，對堿穩(wěn)定； 維生素E對酸穩(wěn)定，對堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰性氣體保護下，也能經受堿的煮沸。,（一）脂溶性維生素的主

4、要理化性質,8,3耐熱性、耐氧化性： 耐熱性 氧化性 VA 好，能經受煮沸 易被氧化 （光、熱促其氧化） V D 好，能經受煮沸 不易被氧化 V E 好，能經受煮沸 在空氣中能慢慢被氧化 （光、熱、堿促其氧化）,9,根據(jù)上述性質，測定脂溶性維生素時，通常： 皂化樣品 類脂物和維生素分開 有機溶劑提取脂溶性維生素(不皂化物) 濃縮 溶于適當?shù)娜軇?測定。 （食物中脂溶性維生素常與脂肪共存，一道被人體吸收，所以要除去脂肪，防止干擾。） 在皂化和濃縮時，為防止維生素的氧化分解，常加入抗氧化劑(如焦性沒食子酸、維生素C等)。 對于A、D、E共存的樣品，或雜質含量高的樣品，在皂化提取后，還需進行層析分離

5、。,10,常用的測定方法有: 薄層色譜法、分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。 高效液相色譜法：快速、高效、高靈敏度等優(yōu)點， 是我國衛(wèi)生標準分析方法,（二）脂溶性維生素的測定方法,11,食品中VA和VE的測定 （GB5009.82-2003) 維生素A： 存在于動物性脂肪中，主要來源于肝臟、魚干油、蛋類、乳類等動物性食品中； 植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡蘿卜素，它在人體內可轉變?yōu)閂A，故稱為VA原; 包括A1和A2。 維生素E：,12,（第一法）HPLC測定VA和VE,一、原理 食品樣品經皂化處理后，用有機溶劑將食品中的脂溶性維生素（如維生素A、維生素E）從不可皂化的部分提

6、取出來，經過濃縮除去有機溶劑，再用適當?shù)娜軇┤芙夂?，用HPLC法C18反相柱將VA和VE分離，經紫外檢測器，用內標法測定其含量。,13,二、樣品處理 （1）皂化： 稱取適量樣品（含VA30g,VE40g）于三角瓶中，加30mL無水乙醇，振搖使樣品分散；加入5mL，100g/L抗壞血酸和2mL苯并e芘溶液（內標）混勻，加入10mL氫氧化鉀(1:1) ，混勻，于沸水浴上 回流30min，使皂化完全（若有混濁現(xiàn)象，表示皂化完全），皂化后立即放入冰水中冷卻；,14,（2）提?。?將皂化液移入分液漏斗，先用50mL水分2次洗滌皂化瓶（若有渣，可經過脫脂棉過濾），再用100mL無水乙醚分2次洗滌皂化瓶及殘

7、渣，所有乙醚洗液并入分液漏斗中，振搖兩分鐘（注意放氣），靜止分層后，棄去水層；然后每次用100mL水將乙醚液洗至中性，需洗4-5次。,15,（3）濃縮： 將乙醚提取液經無水硫酸鈉濾入150mL旋轉蒸發(fā)瓶內，用約15mL 乙醚洗滌分液漏斗和無水硫酸鈉2次，洗液并入蒸發(fā)瓶中，于55水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，待瓶中乙醚剩余約2mL時，取下蒸發(fā)瓶，用氮氣吹干乙醚，隨即加入2mL乙醇，充分混合、溶解提取物。將乙醇移入塑料離心管中，于離心機上離心5min，上清液供色譜分析用。,16,三、所需主要儀器 高效液相色譜（帶紫外分光檢測器） 旋轉蒸發(fā)器 高速離心機（帶離心管） 恒溫水浴鍋 紫外分光光度計 說明：國

8、標中用其來標定VA和VE的濃度,17,四、液相色譜分析 色譜參考條件： 預柱：ODS 10m（4mmx4.5cm) 分析柱：ODS 5m（4.6mmx25cm) 流動相：甲醇：水98：2，混勻，臨用前脫氣； 紫外檢測器波長：300nm，量程0.02； 進樣量：20L; 流速：1.651.70mL/min,18,測定 （1）配制標準溶液 VA標準溶液：將VA標準品用無水乙醇溶解配制成濃度為1mg/ml; VE標準溶液:用無水乙醇分別溶解-生育酚、-生育酚、-生育酚3種標準品，配制成濃度為1mg/ml的標準液； 內標溶液：將苯并e芘用無水乙醇配制成濃度為10g/ml; （2）繪制標準曲線 將一定量

9、的VA標準溶液、3種VE標準溶液和內標溶液混和均勻，對其混和液進行色譜分析，以維生素峰面積和內標物峰面積之比為縱坐標，以維生素濃度為橫坐標，繪制標準曲線（直線回歸方程）。,19,（3）樣品測定 取試樣濃縮液20l注入色譜儀中，進行檢測； 定性：用標準物色譜峰的保留時間定性； 定量：根據(jù)色譜圖求出某種維生素峰面積與內標物峰 面積的比值，以此比值由回歸方程求出維生素含量； 五、結果計算 X：某種維生素的含量，mg/100g ：由標準曲線上查到的某種維生素含量，g/mL V：樣品濃縮后定容體積,mL m：樣品質量，g,20,水溶性維生素的理化性質 維生素B1的測定 維生素B2的測定 維生素C的測定,

10、三、水溶性維生素的測定,21,易溶于水，不溶于大部分有機溶劑； 在酸性介質中穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定； 易受空氣、光、熱、酶、金屬離子的影響。,（一）水溶性維生素的主要理化性質,22,（二）維生素B1的測定,VB1又叫硫胺素、抗神經炎素 1、食品中VB1的存在形式 常以游離態(tài)存在； 復合脂形式存在（磷蛋白）； 輔羧酶形式存在 VB1在酵母、米糠、麥胚、花生、黃豆以及綠色 的蔬菜和牛乳、蛋黃中比較豐富，動物組織不如植物 含量豐富。,23, VB1在中性、堿性下不穩(wěn)定，易分解； VB1在酸性條件下穩(wěn)定，即使加熱酸性也穩(wěn)定； VB1為白色結晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。,

11、2.VB1的性質,24,3.維生素B1的測定方法,紫外分光光度法: 適用于VB1含量高的樣品,靈敏度和準 確度較差; 高效液相色譜法 適用于食品中微量VB1的測定 熒光法 世界各國都用熒光法測定; 熒光法是我國國家標準分析方法（GB/T 5009.84-2003）,25, 原理： 硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中，被氧化成一種蘭色熒光物質，即為硫色素，在紫外光下，硫色素發(fā)出熒光，在一定條件下，其熒光強度與硫色素濃度成正比，即與硫胺素含量成正比。,26,（2）定量方法,標準曲線法： 配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度。,27,(

12、3). 操作步驟 試樣處理 樣品勻漿（或粉碎）于低溫冰箱中冷凍保存。 提取 1) 水解 2) 酶解,28,吸附劑采用的是人造浮石。 將提取液加入人造浮石交換柱中，VB1被吸附上去，吸附上去后，再用熱水淋洗，洗去雜質，最后用熱的酸性氯化鉀（25%KCl-HAC）把VB1洗脫下來，這樣就得到純VB1。,樣品,熱水,酸性氯化鉀,收集酸性氯化鉀定容, 凈化,29, 氧化 靜置 過濾 脫水,30, 熒光強度測定(通過熒光分光光度計可以測得) 激發(fā)波長365nm；發(fā)射波長435nm； 激發(fā)波狹縫5nm；發(fā)射波狹縫5nm。 （4）方法說明 本方法適用于各類食物中硫胺素的測定，但不適用于有吸附硫胺素能力的物質

13、和含有影響硫色素熒光物質的樣品； 酸解、水解的目的：使結合型的VB1成為游離型的； 紫外線會破壞硫色素，所以硫色素形成后，反應瓶要用黑布遮蓋或在暗室中進行熒光測定，并且要迅速測定；,31,維生素B2又稱核黃素 測定方法主要有： 微生物法、熒光法、HPLC法 GB/T 5009.85-2003 熒光法（第一法） 微生物法（第二法）,（三）維生素B2的測定,32,熒光法測維生素B2,1.原理 核黃素在440500nm波長光照射下發(fā)生黃綠色熒光。在稀溶液中其熒光強度與核黃素的濃度成正比。在波長525nm下測定其熒光強度。試液再加入低亞硫酸鈉(Na2S2O4)，將核黃素還原為無熒光的物質，然后再測定試

14、液中殘余熒光雜質的熒光強度，兩者之差即為食品中核黃素所產生的熒光強度。 為使VB2游離出來，采用需經酸解和酶解 為消除干擾，試樣通過氧化處理和柱層析處理。,33,2.測定步驟 （1）樣品提取,稱樣,三角瓶,高壓水解,鹽酸溶液,調pH值,氫氧化鈉溶液,酶解,淀粉酶,定容,蛋白酶,34,（2）氧化去雜,樣品提取液,具塞試管,水,雙氧水,冰乙酸,高錳酸鉀,氧化去雜,褪色,標準液按相同方法進行,35,（3）柱層析,樣品液,水,丙酮-乙酸-水混合液,水,收集洗脫液 定容,*標準液按相 同操作進行,36,（4）熒光測定 激發(fā)光波長440nm，發(fā)射光波長525nm，測量樣品管及標準管的熒光值。 待樣品及標準

15、的熒光值測量后，在各管的剩余液中加0.1mL 20%低亞硫酸鈉溶液，立即混勻，在20s內測出各管的熒光值，作為各自的空白值。,37,3.計算 X：樣品中核黃素含量，mg/100g A：試樣熒光值 B：試樣空白熒光值 C：標準熒光值 D：標準空白熒光值 m：樣品質量，g m1：標準管中核黃素含量g f：稀釋倍數(shù) 100/1000：樣品核黃素含量的換算系數(shù),38,維生素C是一種已糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以被人們稱做抗壞血酸; 廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑橘等食品中含量較多。它是氧化還原酶之一，本身易被氧化，但在有些條件下又是一種抗氧化劑。,

16、（三）維生素C的測定,39,維生素C具有較強的還原性，對光敏感，氧化后的產物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性；進一步水解則生成2，3 -二酮古樂糖酸，失去生理作用。 在食品中維生素C就是以還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸型這3種形式存在的；食品分析中的所謂總抗壞血酸是指抗壞血酸和脫氫抗壞血酸二者的總量，不包括2，3 -二酮古樂糖酸和進一步氧化的產物。,40,維生素C 的測定方法,測定維生素C 的方法有： 熒光法，高效液相色譜法，2，4 二硝基苯肼比色法， 2，6 二氯靛酚滴定法，等 GB/T 5009.862003 蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸含量測定方法 第一法：熒光法 第二法：2，4二硝基

17、苯肼比色法,41,（1）原理： 試樣中還原型抗壞血酸經活性炭氧化為脫氫抗壞血酸后，與鄰苯二胺反應生成有熒光的喹唔啉，其熒光強度與抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測定食品中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。 注意：脫氫抗壞血酸可與硼酸結合生成復合物，而不與鄰苯二胺反應生成熒光物質，由此可以消除雜質的干擾。（空白試驗）,（第一法）熒光法（測總抗壞血酸）,42,（2）試劑： 偏磷酸冰醋酸溶液：稱取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，加水稀釋至500mL過濾后，貯存于冰箱中； 硫酸：0.15mol/L 偏磷酸乙酸硫酸溶液：稱取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用0.015molL-1硫酸稀釋至500m

18、L； 乙酸鈉溶液：稱取500g乙酸鈉溶解并稀釋至1L； 硼酸乙酸鈉溶液：稱取硼酸9g，加入35mL乙酸鈉溶液，用水稀釋至1000mL； 鄰苯二胺溶液：稱取20mg鄰苯二胺鹽酸鹽溶于100mL水中；,43,抗壞血酸標準溶液：準確稱取0.500g抗壞血酸溶于偏磷酸冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，吸取上述溶液5mL，再用偏磷酸冰醋酸溶液定容至50mL； 抗壞血酸標準使用溶液：100g/mL 百里酚藍指示劑(麝香草酚藍)：變色范圍pH1.2(紅)2.8(黃)； 活性炭：取50g活性炭加入250mL10%鹽酸，加熱至沸，減壓過濾，用蒸餾水沖洗活性炭，檢查濾液中無鐵離子為止，于110120烘干。

19、（3）儀器：熒光分光光度計或具有350nm及430nm 波長的熒光計；搗碎機。,44,（4）操作步驟： 試樣的制備：稱取100克鮮樣,加100mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入搗碎機內打成勻漿，先取少量樣品加入1滴百里酚藍，若顯紅色(pH=1.2)，即用偏磷酸冰醋酸溶液定容至100mL；若顯黃色(pH=2.8)，即用偏磷酸冰醋酸硫酸溶液定容至100mL，定容后過濾備用。 測定： 氧化處理：將上述濾液及抗壞血酸標準使用液各100ml轉入三角瓶中加入12g活性炭振搖12分鐘，過濾。即試樣氧化液和標準氧化液，待測定。,45,各取10mL標準氧化液于2個100mL容量瓶中，分別標明“標準”及“標準空白” 各取

20、10mL試樣氧化液于2個100mL容量瓶中，分別標明“試樣”及“試樣空白” 于“標準空白”及“試樣空白”中各加5mL硼酸-乙酸鈉溶液，混合搖動15min，用水稀釋至100mL，在4冰箱中放置23小時，即得“標準空白”溶液及“試樣空白”溶液，備用。 于“試樣”及“標準”中各加5mL /L乙酸鈉溶液，用水稀釋至100mL,即得“試樣”溶液及“標準”溶液，備用。,46,標準曲線的制備： 取上述“標準”溶液（抗壞血酸含量10g/mL）0.5、1.0、1.5和2.0mL標準系列，取雙份分別置于10mL帶蓋試管中，再用水補充至2.0mL。（平行2次，做標準曲線） 取中“標準空白”溶液，“樣品空白”溶液及

21、“樣品”溶液各2mL，分別置于10mL帶蓋試管中。在暗室中迅速向各試管中加入5mL鄰苯二胺溶液，振搖混合，在室溫下反應35min，于激發(fā)光波長338nm、發(fā)射光波長420nm處測定熒光強度。標準系列熒光強度分別減去標準空白熒光強度為縱坐標，對應的抗壞血酸含量為橫坐標，繪制標準曲線或進行相關計算，其直線回歸方程供計算時使用。,47,（5）結果計算： 式中 X-試樣中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸總含量，mg/100g； c-由標準曲線查得或由回歸方程算得試樣溶液濃度，g/mL m-試樣的質量，g； V-熒光反應所用試樣體積，mL； F-試樣溶液的稀釋倍數(shù)。,48,（第二法）2，4二硝基苯肼比色法 1.原

22、理 先將樣品中的還原型抗壞血酸用活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，加2，4二硝基苯肼生成紅色脎，根據(jù)脎在硫酸溶液中的含量與總抗壞血酸含量成正比進行比色測定。,49,2.試劑 提取Vc用：20g/L草酸，10 g/L草酸 氧化處理用：活性炭（經HCl處理無鐵離子） 控制氧化用：20g/L硫脲、10g/L硫脲 顯色用：20g/L2，4二硝基苯肼溶液，硫酸 1mg/mL抗壞血酸標準溶液 3.主要儀器 恒溫箱或恒溫水浴鍋 紫外可見分光光度計 組織搗碎機,50,4.操作步驟 樣品中Vc的提取和處理 提?。悠分苽洌?干樣：樣品（1-4g）+適量10 g/L草酸，磨成勻漿，用10 g/L草酸定容至100mL容量瓶。過濾，得提取液。 鮮樣：樣品+等量的20 g/L草酸，搗碎成勻漿，取1040g勻漿，用10 g/L草酸定容至100mL容量瓶。過濾，得提取液。 注意：不易過濾的樣品，可離心沉淀后取上清液再過濾。,51,氧化處理 取25mL提取液+2g活性炭，振搖1min，過濾。要棄去初濾液； 取10mL氧化提取液+10mL20g/L硫脲； 此20mL氧化稀釋液為待測液，相當于把提取液稀釋了2倍。,52,（2）呈色反應 取3支帶塞試管，各加入4mL氧化稀釋液，留一支空白，另兩支各加1.0mL20g/L2，4二硝基苯肼溶液，37恒溫3h。 取出，空白管在室溫下