1、Chap.7 微生物遺傳變異和育種,微生物遺傳學研究意義 1） 微生物學的主要分支 2）為生命遺傳現象的解釋提供依據 3）是分子生物學發(fā)展的基礎學科 4）促進工業(yè)微生物菌種的選育,.1 遺傳變異的物質基礎,一、證明遺傳物質的三個典型實驗,-細菌轉化實驗 -噬菌體感染實驗 -植物病毒的重建實驗,1、細菌轉化實驗 - 動物試驗 (Grifith,1928),-細菌培養(yǎng)實驗 S（死）+R（活） S（ 少量活） +R（活） S（無細胞提取液）+R（活） S（ 少量活） +R（活）,-細菌培養(yǎng)試驗（Avery，1944）,2噬菌體感染實驗 (Hershey;Chase,1952),3植物病毒的重建實驗

2、(Fraenkel-Conrat,1956),二、遺傳物質在細胞內的存在部位和方式,（一）真核與原核微生物遺傳物質比較,原核與真核微生物基因組大小,細菌染色體數目與形狀,細菌染色體結構,真核微生物染色體結構 (示核小體）,真核生物基因結構,真核微生物基因表達控制,（二）原核生物的質粒,質粒： 游離于染色體外， 獨立復制，環(huán)狀、共價、 閉合dsDNA分子， 即 cccDNA。,質粒的特點 1）大小： 大質粒： 60kb、1/cell 小質粒： 10-20/cell,2）自主復制能力：型復制、滾環(huán)復制,數量控制：嚴緊型 ；松弛型,3）轉移性：,Tra區(qū)基因：,附加體：某些質粒既可整合進宿主染色體，

3、又可與染色體脫離，稱之。,4）質粒的消除： -理化因子 -原生質體誘導法,5）不相容性： 兩種親緣關系相近的質粒不能穩(wěn)定地存在于同一個細胞中。,（G-菌的部分不相容群）,質粒的遺傳表型 1）F質粒（致育因子） Tra基因：編碼轉移相關 蛋白；合成性纖毛,2）R質粒（抗藥因子） -RTF基因（抗性轉移因子） -抗性決定子 （抗抗生素、抗藥、抗種金屬）,3）Col質粒（大腸桿菌素因子） -產大腸桿菌素 細菌素：由細菌質粒編碼產生的只能 抑制或殺滅近緣細菌或同種 不同菌株的蛋白質。 Col質粒類型： -非接合型：松弛型 -接合型：嚴緊型,4）Ti質粒：合成冠癭堿、大型質粒 5）Ri質粒：產生根毛、大

4、型質粒,7）降解質粒：降解、接合,8）致病性質粒： 溶血素、腸毒素（S.aureus） 9）共生固氮質粒： -結瘤基因（nod） -固氮基因（nif） 10）隱蔽質粒： - 未有明確表型,工程質粒-pBR322 主要特點： 1）分子量小 2）穩(wěn)定、松弛型復制 3）可大量擴增 4）容易分離 5）可攜帶小于10kb外源DNA 6）帶有2個選擇標記 ; 7）多個單一酶切位點 8）容易轉化,利用選擇標記鑒別攜帶外源片段的轉化子 (雙抗菌素對照篩選）,建議讀物,.2 基因突變和誘變育種 一、基因突變 野生型菌株：從自然界分離獲得的菌株， 稱之為。 基本培養(yǎng)基(MM)：滿足野生型菌株生長最 低營養(yǎng)要求的合

5、成培養(yǎng)基。,（一）突變類型 營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株由于突變而喪失 了 某種營養(yǎng)合成能力，而無法在基本培 養(yǎng)基上生長的變異類型。 表示： 基 因：his+，his - ； 表 型：His + ，His -,抗性突變型： 野生型菌株由于突變而產了對某些化學藥物或致死物理因子抗性變異類型。 表示： 基 因： strr、strs； tetr、tets； 表 型：Str r ， Str s,條件致死突變型： 某些菌株或病毒經基因突變后，在某種條件可生長并實現表型，而在另一條件卻無法生長繁殖的突變類型。 (如溫度敏感突變株：Ts） 形態(tài)突變株 抗原突變株 產量突變株,突變株類型劃分： -選擇性突變株：營養(yǎng)

6、缺陷型、抗性 突變型、條件致死突變型 -非選擇突變株：形態(tài)、抗原、產量 突變型,（二）突變率及其撿出 突變率： 某一細胞在每一世代中發(fā)生突變的幾率。常用單位群體中每一世代產生的突變株的數目來表示。,突變株的撿出及突變率的計算,撿出方法： 1）選擇性突變株 -營養(yǎng)缺陷型 -抗藥性突變 回復突變:,（三）基因突變的自發(fā)性與不對稱性 突變的自發(fā)性：基因可自發(fā)產生突變。 （輻射、自身有害物質、堿基配對錯誤） 突變的不對應性：突變性狀與引起突變 的環(huán)境因素無直接對應關系。,平板影印培養(yǎng)試驗 (Lederberg),（四）基因突變及其機制 1、誘發(fā)突變 (點突變, 畸變) 1)點突變 (1)堿基置換 -轉

7、換 -顛換,可能的突變型： 錯義突變 無義突變 同義突變,相關的誘變劑 直接引起置換： 亞硝酸、亞硝基胍、羥胺、烷化劑 間接引起置換： 堿基類似物 （5BU, 5-AU),(2）移碼突變 DNA序列中插入或缺失少數核苷酸，從而使該處后面遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生改變的突變。,2）染色體畸變 DNA分子的大段損傷，包括缺失、重復、 插入、易位（轉座）和倒拉等。,轉座：DNA分子通過非同源重組方式， 從染色體的某一部位轉移到另一部位的 現象。,轉座因子 凡具有轉座作用的DNA序列均稱之。 特點： -轉座作用 -末端重復序列 -轉座酶基因,轉座因子類型,插入序列 轉座子(或稱復合轉座子） 轉座噬菌體,a

8、）插入序列 (IS) b） 轉座子(Tn),轉座機理,轉座子的遺傳效應和生物學意義,（復制型轉座）,遺傳效應 1）插入突變 2）DNA重排 意義： 進化，獲得突變株，抗藥性 鑒定必須基因,（五）紫外線對DNA的損傷及其修復,1損傷的機理： 形成胸腺嘧啶二聚體 2、修復作用 1）光復活作用 光解酶-二聚體復合物為光激活,2.暗修復作用：,3、重組修復 4、SOS修復,二、 突變與育種 （一）自發(fā)突變與育種(定向培育） （二）誘變育種,1、基本原則（應考慮的問題） 1） 誘變劑的選擇 (有效性,安全性，簡便性),誘變劑誘變效果測定（回復突變率的測定） -艾姆氏試 驗(檢測三致物質）,2）出發(fā)菌株

9、3）誘變菌株的狀態(tài) -處理單胞（孢）懸液 -選擇單倍體或單核細胞 4）劑量：低劑量； (表示方法) 5）提高檢出效率 -利用形態(tài)特征 -鑒別培養(yǎng)基,利用鑒別培養(yǎng)基檢出突變株 -蛋白酶高活性菌株的檢出 （酪蛋白為N源，加HgCl2觀察透明圈） -淀粉酶高活性菌株的檢出 （淀粉為C源，加I2液觀察透明圈） -有機酸高產菌株的檢出 （培養(yǎng)基加CaCO3觀察透明圈）,6）設計高效的 篩選方案 -初篩（數量、 定性） -復篩（質量、 定量） 7）創(chuàng)新性的 篩選方法,2、營缺型的篩選 （1）三種基本培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基- :滿足野生型菌株生長 最低營養(yǎng)要求的組合培養(yǎng)基。 完全培養(yǎng)基+ ：滿足所有營缺型菌株

10、生長營養(yǎng)要求的天然或半組合培養(yǎng)基。 補充培養(yǎng)基A，B ：滿足相應營缺型 菌株生長營養(yǎng)要求的組合或半組合培養(yǎng)基。,（2）三類遺傳型個體 野生型：從自然界分離獲得的菌株不論 營養(yǎng)狀況如何，均稱為。（A+B + ） 營缺型：野生型菌株經誘變由于代謝障礙，而必須添加某種物質才能生長的突變株。 （A+B - ） （A-B + ） 原養(yǎng)型：營缺型回復突變后的菌株。 （A+B + ）,基本基 完全基 補充基 野生型 + + + 營缺型 + + 原養(yǎng)型 + + +,（3）篩選步驟 1）誘變 2）淘汰野生型：抗生素法、菌絲過濾法 3）檢出： 夾層培養(yǎng)法；限量補充法 逐個檢出法；影印平板法,夾層培養(yǎng)法,（4）鑒定

11、缺陷型(生長譜法) 1）制備基本 培養(yǎng)基； 2）加充分洗 滌菌懸液； 3）加待測營 養(yǎng)物； 4）觀察生長。, 定位（點）誘變,盒式誘變 寡核苷酸引物誘變,Strain improvement for fermentation and biocatalysis processes by genetic engineering technology,建議讀物,.3 基因重組 基因重組（遺傳重組）： 兩個獨立基因組內的遺傳物 質，通過一定的途徑轉移到一 起，形成新的穩(wěn)定的基因組過程。,遺傳工程 -基因重組技術 經典、同源、生物自然屬性、 體內 -DNA重組技術： 分子水平、同- 異源、體外,一、原核

12、生物的基因重組 （一）轉化 受體菌直接吸收供體菌游離的 DNA片段而獲得部分遺傳性狀的現 象。,1、轉化的基本條件 （1）感受態(tài)： 受體菌最容易接受外源DNA 片段并能實現轉化的一種生理狀態(tài)。 影響因素： -遺傳因素（感受態(tài)因子;種屬的特異性；） -外部因素（CAMP、聚乙二醇、二價陽 離子-低溫低滲CaCl處理、培養(yǎng)條件）,轉化頻率：0.11%（很低），最高10%，質粒 為良好的轉化因子。 濃度：10-5 ug/ml,結構：一般轉化因子都是線狀雙鏈DNA，少數為 線狀單鏈DNA。,大?。好恳晦D化DNA片段分子量約 1107， 約占 染色體組0.3%，平均 15個基因。,（2）轉化因子,轉化因

13、子,非交換,2、轉化過程 1）酶解和吸收單鏈 2）同源區(qū)配對、 整合 3）復 制 4）形成轉化子,3.轉染(Tranfection) 提純的病毒DNA或RNA進入宿主細胞并增殖出正常的病毒后代現象。 If DNA from a virus is used as the cloning vector, the process is called transfection. (Introduction to microbiology, John L. Ingraham ),（二）轉導 完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介,使受體細胞獲得供體細胞部分遺傳性狀的現象。,1、普遍轉導 完全缺陷噬菌體對供體任何

14、DNA小片 段進行“誤包”,而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現象，包括完全普遍轉導和流產 普遍轉導兩種類型。,完全轉導 (形成轉導子),感染復數：感染的噬菌體數/被感染細胞數,流產轉導：(僅形成一個轉導子, 產生小菌落),經轉導進入受體菌的供體菌DNA片段，在受體菌內不交換、整合、復制，也不迅速消失，僅進行轉錄、翻譯、性狀表達轉導現象。,、局限轉導 部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌少數特定的基因攜帶到受體菌中并獲得表達的轉導現象。,A、低頻轉導（） ）噬菌體感染 ）誘導裂解 ）不正常切離（低頻轉導裂解物）（ dgal、 dbio） ）形成局限轉導子,B、高頻轉導（） 1）概念 低頻轉導(LFT)裂解物

15、：溶源噬菌體感染后， 帶少數局限轉導噬菌體的細胞裂解物。 雙重溶源菌：同時感染有正常噬菌體 和缺陷噬菌體的受體菌。 (來源：LFT裂解物以高的感染復數感染宿主),雙重溶源菌,2）高頻轉導：在局限轉導中，用雙重溶源 菌誘導后產生的高頻轉導裂解物轉導受體菌 可獲得的高達 50% 的轉導子，稱之。 3）過程： 1）雙重溶源菌 2）誘導，獲得高頻轉導裂解物 3）高頻轉導裂解物低m.o.i感染受體菌,（3）溶源轉變,溫和噬菌體 感染宿主后，宿主通過 溶源化而獲得免疫性以外新性狀的現 象。 白喉毒素： 白喉桿菌的-噬菌體帶有“TOX”基因,（三）接合 接合：通過細胞間的直接接觸,由質粒介導的遺傳物質轉移的

16、現象. 接合子：通過接合 而獲得新的遺傳 性狀的受體細胞。, 存在方式:四種接合型菌株 1、F -,2、 F+ 菌株,Orit：起始子,3、Hfr菌株：高頻重組菌株， F+整合在染色體上 成為附加體的狀態(tài)，若與F -接合，有很高的重組 頻率。 1）細胞接觸 2）Hfr斷裂、 轉移、 復制 3）接合中斷 4）形成接合子,利用接合中斷法繪制染色體圖譜,中斷雜交試驗,基因測序 （鳥槍法） 1.構建文庫 2.隨機測序 3.片斷排列 4.編輯,4、 F 菌株 （質粒帶有部分染色體片斷的菌株） 初生F 菌株 次生F 菌株,建議讀物,基因水平轉移是細菌進化的主要動力 微生物功能基因組學,（四）原生質體融合,通過人為方法,使遺傳性狀不同的兩個 細胞的原生質體融合,繼而遺傳重組,借 以獲得兼有雙親性狀,遺傳性穩(wěn)定的融 合子的過程。,主要步驟： 1）選擇親本 2）制備原生質體 3）促融 4）原生質體再生 5）融合子檢出 6）篩選,Metabolic engineering by genome shulffling G.Steph