1、第十一單元 生物技術實踐學案61 DNA和蛋白質技術考綱要求1.蛋白質的提取和分離 實驗與探究2.PCR技術的基本操作和應用 實驗與探究復習要求1.根據(jù)蛋白質分子的特點,選擇不同的方法提取和分離2.PCR技術的原理和條件3.PCR技術的基本操作基礎自查一、血紅蛋白的提取和分離1凝膠色譜法： 。2電泳(1)概念： 。(2)特點： 。3實驗操作(1)樣品處理： 。(2)粗分離： 。(3)純化： 。(4)純度鑒定： 。二、PCR技術擴增DNA片段1PCR技術(1)PCR： 的簡稱，是一種 的技術。(2)擴增方向： 。(3)引物特點： ，能 ，用于PCR的引物長度通常為2030個脫氧核苷酸。(4)原理

2、： 。(5)條件： 。2過程(1)變性： 。(2)復性： 。(3)延伸： 。3 結果： 。 課堂深化探究一多聚酶鏈式反應擴增DNA片段1細胞內DNA復制與體外DNA擴增(PCR技術)的比較細胞內DNA復制PCR不同點解旋 酶 引物 能量 溫度子鏈合成相同點 2.PCR反應的過程及結果(1)PCR反應過程：變性： 復性：延伸：(2)結果：特別提醒DNA復制需要引物的原因：DNA聚合酶不能從5端開始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈。二、血紅蛋白的提取和分離 1方法及原理方法原理凝膠色譜法 電泳法 2.實驗操作程序(1)樣品處理 (2)粗分離 圖示：注意：透析時間為12 h。透析袋是用硝酸纖維素

3、制成，小分子可自由進出，而大分子保留在袋內。(3)純化：一般采用凝膠色譜法對血紅蛋白進行分離和純化。(4)純度鑒定：一般用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，來測定蛋白質的分子量，即對血紅蛋白進行純度鑒定。3結果分析與評價項目分析血液樣品的處理分層明顯 凝膠色譜柱的裝填 血紅蛋白的分離特別提醒用凝膠色譜法分離和純化蛋白質，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。在蛋白質分離過程中，應仔細觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動情況，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。對應訓練1.多聚酶鏈式反應(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。PCR過程一般經歷30多次下述循環(huán)

4、：95 條件下使模板DNA變性、解鏈55 條件下復性(引物與DNA模板鏈結合)72 條件下引物鏈延伸(形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關PCR過程的敘述，不正確的是()。A變性過程中破壞的是DNA分子內堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現(xiàn)B復性過程中引物與DNA模板鏈的結合是依靠堿基互補配對原則完成的C延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、4種核糖核苷酸DPCR與細胞內DNA復制相比，其所需要酶的最適溫度較高2.多聚酶鏈式反應(PCR)是一種體外擴增DNA片段的技術。可用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等方面?；卮鹨韵聠栴}：(1)細胞內DNA復制過程中，引物的作用是_

5、，而且DNA復制的前提是_。(2)PCR利用了_原理，可通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結合。(3)PCR技術用到的酶是_，與細胞內DNA復制時發(fā)揮相同作用的酶相比區(qū)別在于_。(4)下面表格是DNA體內復制與PCR反應的部分比較結果。通過比較分析，請推導出PCR反應合成DNA子鏈時能量來源于_。原料ATPDNA體內復制四種脫氧核苷酸需要PCR反應脫氧胞苷三磷酸、脫氧腺苷三磷酸脫氧胸苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸不需要(5)假如PCR反應所用的引物含有放射性、模板不具有放射性，且引物不被切除，則經過n次循環(huán)，具有放射性的脫氧核苷酸鏈占總鏈數(shù)的比值為_。3.如圖表示血紅蛋白提取和分離的部分實驗裝置，請回答

6、下列問題。(1)血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分，其在紅細胞中的作用體現(xiàn)了蛋白質具有_功能。(2)甲裝置中，B是血紅蛋白溶液，則A是_；乙裝置中，C溶液的作用是_。(3)甲裝置用于_，目的是_。用乙裝置分離蛋白質的方法叫_，是根據(jù)_分離蛋白質的有效方法。(4)用乙裝置分離血紅蛋白時，待_時，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。4.下列關于血紅蛋白分離中樣品處理及粗分離的描述，錯誤的是()。A紅細胞洗滌：此操作的目的是去除紅細胞內的雜蛋白B血紅蛋白釋放：此操作需要將洗滌好的紅細胞放入蒸餾水中C分離血紅蛋白溶液：離心后紅色透明液體是血紅蛋白的水溶液D透析：此操作的目的是去

7、除分子量較小的雜質實驗探究（2012岳陽模擬）DNA的粗提取與鑒定的實驗（如圖）：（1）本實驗材料選用雞血細胞液，而不是雞全血，主要原因是雞血細胞液中_含量較高。（2）圖A所示加入蒸餾水的目的是_。（3）通過圖B所示步驟取得濾液后，再向濾液中加入2 mol/L NaCl溶液的目的是_。（4）圖C所示加入蒸餾水的目的是_。（5）為鑒定實驗所得絲狀物的主要成分是DNA，可用_試劑進行檢測，在沸水浴條件下，可以看到顏色反應為_色。限時訓練題組一DNA粗提取與鑒定及PCR擴增技術1.下列關于PCR的描述中，正確的是()PCR是一種酶促反應 引物決定了擴增的特異性 擴增DNA利用了熱變性的原理 擴增的對

8、象是氨基酸序列A B C D2.PCR(多聚酶鏈式反應)技術是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術，如圖表示合成過程。下列說法錯誤的是( )A.A過程高溫使DNA變性解旋，該過程不需要解旋酶的作用B.C過程要用到的酶在高溫下失活，因此在PCR擴增時需要再添加C.如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記，游離的脫氧核苷酸不做標記，控制“945572”溫度循環(huán)3次，則在形成的子代DNA中含有15N標記的DNA占25%D.PCR中由堿基錯配引起的變異屬于基因突變3如圖為“DNA粗提取和鑒定”實驗的相關操作。這些操作目的正確的是()A是洗滌紅細胞，去除血細胞表面的雜質B是溶解DNA，去除不溶于

9、酒精的雜質C溶解DNA，去除不溶于2 mol/L NaCl溶液的雜質D稀釋NaCl溶液，去除不溶于低濃度NaCl溶液的雜質4要使PCR反應在體外的條件下順利地進行，需要嚴格的控制()A氧氣的濃度 B酸堿度C溫度 D大氣的濕度5DNA在NaCl溶液中的溶解度有二重性，隨著NaCl溶液濃度的變化而變化。(1)請在下列濃度的NaCl溶液中，選出能使DNA析出最徹底的一種和溶解度最高的一種()A0.14 mol/L B2 mol/LC0.15 mol/L D0.3 mol/L(2)DNA不溶于酒精，但細胞中的某些物質卻可以溶于酒精溶液，利用這一原理可以_，可以推測溶于酒精的物質中可能有_。(3)利用D

10、NA遇_呈藍色的特性，將該物質作為鑒定_的試劑。題組二血紅蛋白的提取和分離6.（2012江蘇淮安期末）下列關于凝膠色譜法的說法正確的是()A是根據(jù)蛋白質對其他分子的親和力來分離蛋白質的B凝膠是一些微小的無孔的球體，小球體都是由多糖類化合物構成的C相對分子質量較小的蛋白質的路程較長，但移動速度較快D相對分子質量較大的蛋白質只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快7.蛋白質的分離與純化技術是蛋白質研究的重要技術。下列有關敘述不正確的是()A根據(jù)蛋白質分子不能透過半透膜的特性，可將樣品中各種不同的蛋白質分離B根據(jù)蛋白質所帶電荷性質的差異及分子大小等，可通過電泳分離蛋白質C根據(jù)蛋白質相對分子質量的大

11、小，可通過凝膠色譜法分離蛋白質D根據(jù)蛋白質的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法分離蛋白質8.凝膠色譜技術是二十世紀六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離技術，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很好的分離效果，目前已經被廣泛應用于多個領域，請回答：(1)a、b均為蛋白質分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是_，原因是_。(2)若選用SephadexG100，則G表示_。(3)通過凝膠色譜法可將從紅細胞中分離出的血紅蛋白樣品進一步_，在血紅蛋白的提取和分離實驗中有以下操作，試回答：實驗時要對采集到的血液中的紅細胞進行洗滌，洗滌的目的是_。在_作用下，紅細胞會破裂釋放出血紅蛋白

12、。將釋放出的血紅蛋白收集到透析袋中透析，這是樣品的_，而透析的目的是_。實驗最后經過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行_。(4)裝填凝膠色譜柱時，要注意色譜柱內不能有氣泡存在，一旦發(fā)現(xiàn)氣泡必須重裝。這是因為_。高考真題體驗1.(2011廣東理綜，24)以下關于豬血紅蛋白提純的描述，不正確的是()。A洗滌紅細胞時，使用生理鹽水可防止紅細胞破裂B豬成熟紅細胞中缺少細胞器和細胞核，提純時雜蛋白較少C血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過程的監(jiān)測D在凝膠色譜法分離過程中，血紅蛋白比分子量較小的雜蛋白移動慢2.（2011江蘇高考）在利用雞血進行“DNA的粗提取與鑒定”的試驗中，相關的敘述正確的是（ ）A.用蒸餾

13、水將NaCl溶液濃度調至0.14mol/L，濾去析出物B.調節(jié)NaCl溶液濃度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分雜質C.將絲狀物溶解在2 mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑即呈藍色D.用菜花替代雞血作為實驗材料，其實驗操作步驟相同3.（2011山東高考）研究發(fā)現(xiàn)柚皮精油和乳酸菌素（小分子蛋白質）均有抑菌作用，兩者的提取及應用如圖所示。（1）柚皮易焦糊，宜采用_法提取柚皮精油，該過程得到的糊狀液體可通過_除去其中的固體雜質。（2）篩選乳酸菌A時可選用平板劃線法或_接種。對新配制的培養(yǎng)基滅菌時所用的設備是_。實驗前需對超凈工作臺進行_處理。（3）培養(yǎng)基中的尿素可為乳酸菌A生長提供_。電泳法純化

14、乳酸菌素時，若分離帶電荷相同的蛋白質，則其分子量越大，電泳速度_。（4）抑菌實驗時，在長滿致病菌的平板上，會出現(xiàn)以抑菌物質為中心的透明圈。可通過測定透明圈的_來比較柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。學案61 DNA和蛋白質技術答案與解析基礎自查一、血紅蛋白的提取和分離1凝膠色譜法：也稱分配色譜法，是根據(jù)相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法。2電泳(1)概念：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。(2)特點：電泳利用待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3實驗操作(1)樣品處理：通過紅細胞的洗滌、攪拌、

15、離心等操作收集到血紅蛋白溶液。(2)粗分離：通過透析去除血紅蛋白溶液中的相對分子質量較小的雜質。(3)純化：通過凝膠色譜法分離相對分子質量不同的蛋白質。(4)純度鑒定：用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行樣品純度鑒定。二、PCR技術擴增DNA片段1PCR技術(1)PCR：多聚酶鏈式反應的簡稱，是一種體外迅速擴增DNA片段 的技術。(2)擴增方向：總是從子鏈的5端向 3端延伸。(3)引物特點：是一小段RNA 或DNA，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對，用于PCR的引物長度通常為2030個核苷酸。(4)原理：DNA復制原理。(5)條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸、耐

16、熱的DNA聚合酶，同時控制溫度。2過程(1)變性：當溫度上升到90以上時，雙鏈DNA解旋為單鏈。(2)復性：溫度下降為50 左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。(3)延伸：當溫度上升到72 左右時，四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。3結果：DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。 課堂深化探究一多聚酶鏈式反應擴增DNA片段1細胞內DNA復制與體外DNA擴增(PCR技術)的比較細胞內DNA復制PCR不同點解旋解旋酶，邊解旋邊復制80100 高溫解旋，雙鏈完全分開酶解旋酶，DNA聚合酶，D

17、NA連接酶Taq DNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加溫度體內溫和條件高溫子鏈合成一條鏈連續(xù)(先導鏈)，另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由DNA連接酶連接(滯后鏈)兩條子鏈均連續(xù)合成相同點提供DNA模板四種脫氧核苷酸作原料子鏈延伸的方向都是從5端到3端2.PCR反應的過程及結果(1)PCR反應過程：變性：當溫度上升到90 以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈， 復性：系統(tǒng)溫度下降至50 左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合 延伸：當系統(tǒng)溫度上升至72 左右，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈 (2)結果：PC

18、R一般要經歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、復性、延伸三步。兩引物之間的固定長度的DNA序列呈指數(shù)擴增。二、血紅蛋白的提取和分離1方法及原理方法原理凝膠色譜法根據(jù)相對分子質量的大小分離蛋白質電泳法各種分子帶電性質的差異以及分子本身大小、形狀的不同2.實驗操作程序(1)樣品處理紅細胞的洗滌：除去血漿蛋白等雜質，有利于后續(xù)步驟的分離純化；血紅蛋白的釋放：使紅細胞破裂，血紅蛋白釋放出來；分離血紅蛋白溶液：經過離心使血紅蛋白和其他雜質分離開來，便于下一步對血紅蛋白的純化。(2)粗分離原理：透析袋能使小分子自由出入，而將大分子保留在袋內，透析可以除去樣品中相對分子質量較小的雜質。過程：取1 mL的血紅

19、蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 mL的物質的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析12 h。目的(3)純化：一般采用凝膠色譜法對血紅蛋白進行分離和純化。(4)純度鑒定：一般用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，來測定蛋白質的分子量，即對血紅蛋白進行純度鑒定。3結果分析與評價項目分析血液樣品的處理分層明顯樣品處理完成凝膠色譜柱的裝填放一支與凝膠柱垂直的日光燈直接檢查加入大分子有色物質如藍色葡聚糖2 000或紅色葡聚糖，若色帶均勻、狹窄、平整裝填成功血紅蛋白的分離血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨洗脫液緩慢流出分離成功對應訓練1.解析PCR一般要經歷30多次循環(huán)

20、，每次循環(huán)可以分為變性、復性和延伸三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產物也作為模板參與反應，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結合，進行DNA的延伸。DNA變性(9095 )：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。復性(5565 )：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。延伸(7075 )：在Taq酶(在72 左右活性最高)的作用下，以dNTP(三磷酸脫氧核糖核苷酸的縮寫)為原料，從引物的5端向3端延伸，合成與模板鏈互補的DNA鏈。答案C2.解析(1)DNA具有雙螺旋結構，復制時遵循堿基互補配對原則，所以打開氫鍵，DNA聚合酶方可在引物的引導下從引物3端開始連接

21、脫氧核苷酸。(2)PCR技術就是模擬細胞內DNA復制的一項技術，只不過該技術中雙鏈的解旋與結合是通過溫度來控制的，原因在于DNA具有熱變性。(3)TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特性。(4)DNA無論是體內復制還是體外復制，子鏈合成過程中都要消耗能量，而PCR反應不加入ATP供能，且加入的原料也不是四種脫氧核苷酸，可見PCR所用原料在水解成相應脫氧核苷酸時，能釋放出等同于ATP水解的能量。(5)DNA復制n次產生2n個DNA，共有2n1條脫氧核苷酸鏈，由于母鏈不具有放射性，所以具有放射性的脫氧核苷酸鏈占總鏈數(shù)的比值為。答案(1)使DNA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸解開雙鏈(或打開氫鍵

22、)(2)DNA的熱變性(3)TaqDNA聚合酶耐高溫(4)所用原料水解產生相應脫氧核苷酸時所釋放的能量(5)3.解析本題易出錯的地方有：(2)小題中A是磷酸緩沖溶液，C也是磷酸緩沖溶液，它的作用一是保持血紅蛋白的結構不被破壞，再一個是洗脫血紅蛋白，這是常常出錯的地方。透析是粗分離蛋白質的方法，透析后得到的蛋白質還要進行純化和純度鑒定，在鑒定純度時常用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法。正確思路應為：血紅蛋白在氧分壓高的地方與氧結合，在氧分壓低的地方與氧分離，起到運輸氧的作用。圖甲表示的是透析過程，將裝有血紅蛋白溶液的透析袋放入盛有300 mL的物質的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為7.

23、0)。透析的目的是去除樣品中分子質量較小的雜質。圖乙表示用凝膠色譜柱洗脫血紅蛋白的操作示意圖。凝膠實際上是一些微小的多孔球體，小球體內部有許多貫穿的通道。相對分子質量較大的蛋白質不能進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質比較容易進入凝膠內部的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出，相對分子質量中等的分子后流出，相對分子質量最小的分子最后流出，從而使相對分子質量不同的各種分子得以分離。因此相對分子質量不同的蛋白質分子可以獲得分離。這種分離血紅蛋白的方法叫凝膠色譜法。樣品的加入和洗脫的大致過程是：調整緩

24、沖液面滴加透析樣品樣品滲入凝膠床洗脫收集。C溶液是磷酸緩沖液，其作用是洗脫血紅蛋白。待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時開始收集流出液。答案(1)運輸(2)磷酸緩沖液洗脫血紅蛋白(3)透析(粗分離)去除樣品中分子質量較小的雜質凝膠色譜法相對分子質量的大小(4)紅色的蛋白質接近色譜柱底端4.解析紅細胞洗滌的目的是去除血漿中的蛋白質。答案A實驗探究解析：雞血細胞沒有細胞壁，而且細胞內DNA的含量較高。如圖A所示，雞血細胞液中加入蒸餾水后，細胞內滲透壓較高，則雞血細胞吸水而漲破。如圖B所示，溶液中加入2 mol/L NaCl溶液，DNA溶解而雜質析出。如圖C所示，加入蒸餾水后，溶液濃度會降低，當濃度降至0

25、.14 mol/L時，DNA的溶解度最低而析出。在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍色。答案：（1）DNA （2）使血細胞吸水漲破，釋放出核物質DNA （3）使DNA溶解于NaCl溶液 （4）使DNA的溶解度下降而析出 （5）二苯胺 藍限時訓練題組一DNA粗提取與鑒定及PCR擴增技術1.【解析】PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，在高溫條件下，把DNA的雙鏈打開，緩慢冷卻后，又重新結合，需要耐高溫DNA聚合酶，同時，還需要引物，從引物的3端連接脫氧核苷酸。【答案】D2.【解析】高溫所起的作用類似于解旋酶，使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?。C過程為PCR技術的延伸階段，當系統(tǒng)溫度上升至72左右時，溶

26、液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。Taq DNA聚合酶是耐熱的，高溫下不變性，所以一次性加入即可。PCR技術遵循半保留復制的特點。經過三次循環(huán)，共產生23個DNA分子，其中有2個DNA分子含有15N標記?；蛑械膲A基對改變屬于基因突變。【答案】B3C4C PCR利用的是DNA熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合。 5(1)AB(2)去除雜質某些鹽類、蛋白質、糖類或其他大分子物質(3)二苯胺DNA解析由實驗原理可知，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，有利于DNA的析出；DNA主要存在于染色體上，為了把DNA與蛋白質等其他物質分開，采用DN

27、A不溶于酒精的方法，從而達到去除雜質的目的；利用DNA遇二苯胺(沸水浴)成藍色的特性，可以鑒定DNA。題組二血紅蛋白的提取和分離6.【解析】凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質量的大小分離蛋白質有效方法。所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構成的，在小球體內部有許多貫穿的通道，當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時，相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離。【答案】D7.【解析】蛋白質分子不能透過半透膜，而溶液中的小分子物質則可以透過半透膜，因此可以將蛋白質和溶液中的小分子物質分離?！敬鸢浮緼8(1)aa相對分子質量大，無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快(2)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分離范圍(3)純化去除血漿蛋白蒸