1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物,一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：指染色體基因組中整合有外源基因并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。整合到動(dòng)物染色體基因組的外源基因被稱為轉(zhuǎn)基因。,當(dāng)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)外源基因可能只整合到動(dòng)物的部分組織細(xì)胞的基因組，也可能整合進(jìn)動(dòng)物所有組織細(xì)胞的基因組中。如果動(dòng)物所有的細(xì)胞均整合有外源基因，則具有將外源基因遺傳給子代的能力，通常把這類動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物. 如果只有部分組織細(xì)胞的基因組中整合有外源基因的動(dòng)物，把這類動(dòng)物稱為嵌合體動(dòng)物（Chimeric animal）,只有當(dāng)外源基因整合入的細(xì)胞恰為生殖細(xì)胞時(shí)，才能將其攜帶的外源基因遺傳給子代，否則，外源基因?qū)⒉荒軅鹘o子代。 一般用胚胎干細(xì)胞法

2、、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法制備的第1代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物均為嵌合體動(dòng)物，而顯微注射法得到的第1代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，也約有20為嵌合體動(dòng)物。,二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究進(jìn)展, 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的簡(jiǎn)要回顧 1977年，Gordon首先用微注射的方法將外源mRNA和DNA注射到非洲爪贍胚胎，發(fā)現(xiàn)被注入的核酸完全有功能。1980年Brinster等利用小鼠胚胎作了類似的研究，表明外源DNA能夠在胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些工作奠定了生產(chǎn)可以“獲得新功能”的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的科學(xué)思想和方法。,從1980年底至1981年，有6個(gè)研究組相繼報(bào)道成功地獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。Palmiter將5調(diào)控區(qū)缺失后的大鼠生長(zhǎng)激素基因與小鼠金屬硫蛋白1基因啟動(dòng)子相連

3、接，然后將融合基因注入受精小鼠的雄原核，生出21只小鼠，其中7只為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠。在陽(yáng)性鼠中，2號(hào)鼠在出生后74天時(shí)，體重達(dá)到同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠平均體重的1.87倍，這便是著名的“超級(jí)小鼠”.,1985年Hammer等利用該方法成功地制作了轉(zhuǎn)基因兔、綿羊和豬。上述三起研究被認(rèn)為是動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究歷程上的里程碑. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究與開發(fā)是整個(gè)生命科學(xué)中近年來(lái)發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域，1997年，僅各種不同類型的轉(zhuǎn)基因（transgenic）小鼠就達(dá)到了804種.,1988年4月12日美國(guó)專利局批準(zhǔn)了第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物“原癌小鼠”(oncomouse)專利，稍后還獲得了歐洲專利局批準(zhǔn)，打破了“動(dòng)物生命不允許專利”

4、的鐵律。,1998年，美國(guó)和歐洲專利局共批準(zhǔn)了42種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物專利，登記注冊(cè)了88種專利申請(qǐng)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究正在全世界范圍內(nèi)形成一個(gè)前所未有的高潮。并將成為21世紀(jì)生物技術(shù)領(lǐng)域的支柱性產(chǎn)業(yè)。毫無(wú)疑問(wèn)，動(dòng)物轉(zhuǎn)基因正在改變農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、生物材料，甚至是整個(gè)生命科學(xué)的研究與發(fā)展面貌。,2009年2月15日 . 美國(guó)食品和藥物管理局剛批準(zhǔn)首個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的抗血栓藥物 ATryn，人類終于有了第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的藥物上市用于臨床。,我國(guó)的轉(zhuǎn)基因研究起步較晚，從80年代初期開始了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究。中國(guó)科學(xué)院發(fā)育所率先成功地將人-珠蛋白基因、大腸桿菌galk和 gpt基因、牛及人生長(zhǎng)激素等基因，分別注入小

5、鼠受精卵，獲得了多種轉(zhuǎn)基因小鼠。,中國(guó)科學(xué)院水生所在國(guó)際上首先開展了轉(zhuǎn)基因魚的研究，并最早獲得了轉(zhuǎn)基因鯽魚個(gè)體，轉(zhuǎn)基因魚是目前國(guó)內(nèi)獲得最為成功的一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。,我國(guó)較大規(guī)模地進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)是由我國(guó)“863計(jì)劃資助，也是“863”計(jì)劃最早實(shí)施的高技術(shù)項(xiàng)目之一。經(jīng)過(guò)十幾年的努力工作，取得了許多十分顯著的成績(jī) 先后獲得了生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高、對(duì)某些病毒有一定抗性的轉(zhuǎn)基因豬，在乳腺組織中能夠表達(dá)人藥用蛋白凝血因子IX、人生長(zhǎng)激素、人紅細(xì)胞生成素等的轉(zhuǎn)基因羊。最近，還成功地獲得了轉(zhuǎn)基因牛。 1997年，“動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器”的研究與開發(fā)列為“863”計(jì)劃的重大項(xiàng)目，表明一個(gè)新的轉(zhuǎn)基因

6、動(dòng)物研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)高潮已經(jīng)在我國(guó)形成。,通過(guò)將純化的DNA分子導(dǎo)入動(dòng)物種系生殖細(xì)胞基因組，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物基因組的遺傳修飾并使其穩(wěn)定傳代，常用方法： 顯微注射法； 胚胎干細(xì)胞法； 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法,轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理,顯微注射法,同步獲得供體雌鼠（超排的）和受體母鼠（前者是通過(guò)注射雌激素的雌鼠與正常雄鼠交配而得；后著是通過(guò)與接扎雄鼠交配產(chǎn)生） 供體鼠注射人絨毛促性腺激素（HCG）32h后，采集受精卵，此時(shí)受精卵有清晰的原核。 用顯微注射法將純化的外源基因片段導(dǎo)入受精卵的雄原核內(nèi),將微注射后經(jīng)鑒定為存活的受精卵移植到同步交配的假孕母鼠的輸卵管（或子宮）內(nèi)。其中一部分移植卵能夠繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育成個(gè)體 鑒定

7、子代鼠中外源基因的整合和表達(dá)。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系的建立。,優(yōu) 點(diǎn) 能將外源基因?qū)雱?dòng)物生殖細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)動(dòng)物機(jī)體的基因修飾； 可以在機(jī)體整體水平研究基因表達(dá)所導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng) 研究周期短； 缺 點(diǎn) 基因整合位點(diǎn)的隨機(jī)性； 基因表達(dá)的位置效應(yīng)；,胚胎干細(xì)胞法,將外源基因直接導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)篩選后，通過(guò)顯微操作將其注射到囊腔中，在移植入受體的子宮內(nèi)，使其發(fā)育為嵌合體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。,胚胎干細(xì)胞（ES）是指從囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來(lái)的胚胎細(xì)胞，能在體外培養(yǎng)，具有發(fā)育全能性的細(xì)胞 ES細(xì)胞在發(fā)育上類似于早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，當(dāng)被注入囊胚腔后可以參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織嵌合體的形成。

8、 ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的分化潛能和正常整倍體核型兩大特點(diǎn)，是研究哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)育、胚胎分化以及性狀遺傳機(jī)制的理想模型。,選擇合適的載體，將Cre重組酶的 編碼基因與其重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒 將重組質(zhì)粒其轉(zhuǎn)人培養(yǎng)的小鼠胚胎 干細(xì)胞中。 體外篩選穩(wěn)定整合外源基因的胚胎 干細(xì)胞。篩選出的胚胎干細(xì)胞被重 新注射到小鼠囊胚中，并植入到假 孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育為 一個(gè)完整的胚胎。 產(chǎn)出的嵌合體小鼠通過(guò)雜交，獲得 穩(wěn)定整合Cre重組酶的純合體轉(zhuǎn)基因小鼠。,胚胎干細(xì)胞的囊胚注射法構(gòu)建Cre轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,本方法的優(yōu)點(diǎn)是：可用多種方法將外源基因?qū)隕S細(xì)胞，其細(xì)胞的鑒定和篩選比較方便?？深A(yù)先在細(xì)胞水平

9、上檢定外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性等，故轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因整合率的可控制程度高于微注射法。ES細(xì)胞注入囊胚以及囊胚移植到子宮，在操作上比較簡(jiǎn)便。 不足之處在于：建立ES細(xì)胞系本身就是一種高難技術(shù)，其培養(yǎng)條件至今無(wú)突破性進(jìn)展。ES細(xì)胞的保存和維持也不容易。所得個(gè)體為嵌合性，如發(fā)生性嵌合，將導(dǎo)致生殖機(jī)能紊亂和不育。所需時(shí)間較長(zhǎng)。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法,逆轉(zhuǎn)錄病毒具有侵入宿主細(xì)胞并整合于細(xì)胞染色體DNA的能力。將插入有外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA，通過(guò)輔助細(xì)胞包裝成高感染滴度的病毒顆粒，再感染桑椹期的胚胎細(xì)胞，隨后將胚胎導(dǎo)入子宮，可發(fā)育成攜帶外源基因的子代動(dòng)物。原則上載體中可插

10、入各種基因組DNA和cDNA。反轉(zhuǎn)錄病毒載體的容納量在10kb以下，不能插入較大的外源基因。,該方法的優(yōu)點(diǎn)是：感染率高，且胚胎存活率高。病毒DNA隨機(jī)單拷貝整合。宿主范圍廣。 不足之處為：整合位點(diǎn)是隨機(jī)的，其整合率不高。由于病毒感染過(guò)程是在多次卵裂之后外源基因很難整合于所有胚胎細(xì)胞中，故多數(shù)子代動(dòng)物是嵌合體。重組的反轉(zhuǎn)錄病毒不夠穩(wěn)定，外源基因易發(fā)生重排或丟失。病毒載體的容量不大。病毒DNA序列可能會(huì)干擾外源基因的表達(dá)。,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展方向 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高或改良動(dòng)物的生產(chǎn)性能，為人類提供更多更好的優(yōu)良畜牧產(chǎn)品； 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行生物制藥，生產(chǎn)人類所需的治療有關(guān)疑難病癥的特效藥物； 利用轉(zhuǎn)

11、基因動(dòng)物還可以進(jìn)行動(dòng)物的遺傳改造，為人類提供大量可供移植用的器官； 最近的研究結(jié)果顯示，利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還可生產(chǎn)能生物降解、具有特殊強(qiáng)度的生物材料。,發(fā)展方向 l. 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建立人類疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，探討 疾病發(fā)生機(jī)理、治療方法和新藥篩選技術(shù)。 2. 進(jìn)行生物反應(yīng)器制藥，治療人類的疑難病癥。 3. 人類器官移植的器官供體，克服免疫排斥。 4. 應(yīng)用于國(guó)防和生物材料，提高國(guó)家綜合國(guó)力。 5. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動(dòng)物克隆技術(shù)完全結(jié)合，融為一體。,二、克隆動(dòng)物,“克隆”（clone）是指一個(gè)遺傳單位或一個(gè)生命單位，通過(guò)無(wú)性繁殖方式，產(chǎn)生生物學(xué)上完全相同的遺傳單位或生命單位。動(dòng)物克隆是一種通過(guò)核移植過(guò)

12、程進(jìn)行動(dòng)物無(wú)性繁殖的技術(shù)。,一個(gè)細(xì)菌經(jīng)過(guò)20分鐘左右就可一分為二；一根葡萄枝切 成十段就可能變成十株葡萄；仙人掌切成幾塊，每塊落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐莖，一年內(nèi)就能長(zhǎng)出數(shù)百株草莓苗凡此種種，都是生物靠自身的一分為二或自身的一小部分的擴(kuò)大來(lái)繁衍后代，這就是無(wú)性繁殖，無(wú)性繁殖的英文名稱叫“Clone”，譯音為“克隆”。,克隆動(dòng)物：即動(dòng)物的無(wú)性繁殖，主要借助于核移植技術(shù)，將供體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過(guò)精子穿透等有性過(guò)程即被激活，分裂并發(fā)育成個(gè)體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。,英國(guó)PPL公司已培育出羊奶中含有治療肺氣腫的a-1抗胰蛋白酶的母羊。這種羊奶的售價(jià)是6千

13、美元一升。一只母羊就好比一座制藥廠，用什么辦法能最有效、最方便地使這種羊擴(kuò)大繁殖呢？最好的辦法就是“克隆”。同樣，荷蘭PHP公司培育出能分泌人乳鐵蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生產(chǎn)血清白蛋白的羊，這些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案當(dāng)然還是“克隆”。,理論基礎(chǔ),動(dòng)物體細(xì)胞的全息性：幾乎所有的有核體細(xì)胞含有與受精卵相同的一整套遺傳物質(zhì) 卵母細(xì)胞（尤其M卵母細(xì)胞）具備對(duì)細(xì)胞核具備重編程的能力（reprogramming) 供核細(xì)胞與受核細(xì)胞之間的細(xì)胞周期的協(xié)調(diào)性是供核能被有效重編程或正常發(fā)育的重要條件,1997年2月，位于英國(guó)愛(ài)丁堡的Roslin研究所獲得了由成年哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆成的活羊羔

14、（Dolly）。開創(chuàng)了哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆的新紀(jì)元。 Dolly是采用乳腺細(xì)胞經(jīng)過(guò)“饑餓”培養(yǎng)，與去核的卵細(xì)胞進(jìn)行電融合，促使融合細(xì)胞中遺傳物質(zhì)“重排”，然后逐步發(fā)育成胚胎。,1998年美國(guó)夏威夷大學(xué)采用小鼠卵丘細(xì)胞克隆出27只小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，這是繼“多利”以后的第二批哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植后代。 2000年6月，中國(guó)西北農(nóng)林科技大學(xué)利用成年山羊體細(xì)胞克隆出兩只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系統(tǒng)發(fā)育不良而早夭。據(jù)介紹，所采用的克隆技術(shù)為該研究組自己研究所得，與克隆“多利”的技術(shù)完全不同，這表明我國(guó)科學(xué)家也掌握了體細(xì)胞克隆的尖端技術(shù)。,克隆動(dòng)物的技術(shù)路線,主要包括供核的分離、

15、受體細(xì)胞的去核、核卵重組、重組胚的融合、核移植胚的培養(yǎng)與移植。,克隆動(dòng)物的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景,克服動(dòng)物種間雜交障礙，創(chuàng)造出新的物種，培育良種 快速繁殖擴(kuò)群 加快珍稀動(dòng)物繁殖，搶救瀕危動(dòng)物 為了解細(xì)胞發(fā)育的潛能性，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間相互關(guān)系提供研究工具 為研究胚胎發(fā)生及其調(diào)控提供了新視角,克隆動(dòng)物存在的問(wèn)題,作為一個(gè)新興的技術(shù)在實(shí)踐中，克隆動(dòng)物的成功率還很低，維爾穆特研究組在培育“多利“的實(shí)驗(yàn)中，融合了277枚移植核的卵細(xì)胞，僅獲得了“多利”這一只成活羔羊，成功率只有0.36，同時(shí)進(jìn)行的胎兒成纖維細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的克隆實(shí)驗(yàn)的成功率也分別只有1.7和1.1，即使是使用“檀香山”技術(shù)，以分化程度較低的

16、卵丘細(xì)胞為核供體，其成功率也只有百分之幾。 此外，出生的部分個(gè)體表現(xiàn)出生理或免疫缺限。 克隆技術(shù)對(duì)倫理道德的沖擊。,多能性細(xì)胞研究及其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展,周琪，1970年4月出生，博士，研究員，博士生導(dǎo)師；中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所所長(zhǎng)助理，計(jì)劃生育生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任，干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心主任，生殖工程研究組組長(zhǎng)。,主要從事體細(xì)胞重編程機(jī)制、干細(xì)胞及再生醫(yī)學(xué)相關(guān)的研究工作?，F(xiàn)已建立多種克隆動(dòng)物模型（兔、小鼠、牛、大鼠等多種動(dòng)物），在國(guó)際上率先證明了小鼠克隆的可重復(fù)性；首次獲得體細(xì)胞克隆大鼠，研究成果發(fā)表在 Science, Development, Developmental Biology 等刊物, 并得到了Nature、Sci