1、藥理實驗方法學,主講 戴夢紅,簡介,藥理學是一門實驗性學科，其理論、學說、設想和結論都取決于實驗結果，沒有實驗數(shù)據(jù)，就沒有藥理學的知識和內容； 沒有先進的、科學的實驗方法，就沒有可靠的實驗數(shù)據(jù)，就沒有藥理學； 藥理實驗方法是促進藥理學迅速發(fā)展的前提。,理論教學內容（16學時）,藥理實驗方法概述 與藥理學有關的實驗動物的選擇和利用 分子生物學方法和體外試驗在藥理學中的應用 毒理試驗方法,實驗教學內容（32學時）,量效關系曲線測定（ED50和LD50測定） 動物體內磺胺藥濃度測定 藥物血漿蛋白結合率測定 大鼠肝S9制備 小鼠骨髓細胞微核試驗 小鼠精原細胞染色體畸變分析 大鼠肝微粒體制備及其酶活性測

2、定 小鼠碳廓清試驗,第一講 藥理實驗方法學概述,一、實驗藥理學與藥理學實驗,實驗藥理學（experimental pharmaco-logy）是藥理學的重要組成部分，在藥理學的發(fā)展過程中占有極為重要的地位。 是以實驗研究為目的研究藥物作用及其作用機制的學科，是藥理學方向的一門應用性專業(yè)課。其任務是培養(yǎng)學生掌握和熟悉實驗常用儀器的正確使用、實驗標本的制備、條件的控制和指標的選擇、實驗結果的分析、處理等基本技能。,藥理學：一門實驗科學，其發(fā)展和進步都離不開實驗獲得的結果；而藥理學理論的形成也離不開實驗的驗證。 藥理學實驗：以實驗為基礎，按一定的方案，用相關的實驗方法或模型試驗，得到實驗結果，以說明

3、某一藥物的作用特點或作用規(guī)律。,目的,藥理學實驗：具體的實踐過程，通過藥理學實驗，實現(xiàn)實驗藥理學的研究目的，獲得藥理學的新知識，促進藥理學的進步和發(fā)展 實驗藥理學：通過探討藥理學實驗的特點和規(guī)律，使藥理學實驗符合科學、規(guī)范、準確的要求，有效地解決藥理學研究中的實際問題，為藥理學研究提供合理方法和技術保障,內容,藥理學實驗: 解決具體技術問題，是具體的某種實驗方法 實驗藥理學: 研究藥理學實驗過程中的共性問題，提供藥理學實驗研究的基本知識,用途 藥物（尤其是新藥）評價，如作用強度、量-效關系、時-效關系、毒副作用、作用機理等。 包括 主要藥效研究和一般藥理研究,主要藥效研究,原則 用體內、體外兩

4、種以上實驗方法獲得證明，其中一種必須是整體的正常動物或動物病理模型；各項實驗均應有空白對照和已知藥物對照；實驗結果需經統(tǒng)計學處理。 應有兩種以上劑量及不同的給藥方法，溶于水的藥物應做靜脈注射。,一般藥理研究,應用產生主要藥效作用的劑量與給藥途 徑，對清醒動物或麻醉動物進行一般藥理研究 主要研究內容（核心組合實驗） 中樞神經系統(tǒng)：觀察活動情況和行為變化 心血管系統(tǒng)：心率、心電圖、血壓 呼吸系統(tǒng)：對呼吸頻率和深度的影響,二、藥理學實驗的常用方法,物理學方法 化學方法 數(shù)學方法 實驗動物學方法 細胞生物學和分子生物學方法 基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學方法,三、藥理實驗設計的基本原則,重復（replicaton

5、) 隨機（randonmization) 對照（control) 三項統(tǒng)計學原則由實驗設計奠基者Fisher提出至今，基本精神未變，但內容有發(fā)展,（一）重復,重復是實驗設計的首要原則 精確可靠的實驗結果應在相同條件下重復出來 能夠充分重現(xiàn)的實驗，才能稱為可靠的實驗 要有足夠的重復數(shù)（實驗次數(shù)或實驗例數(shù)），才有可能做出正確的結論。,重復原則的含義,重復穩(wěn)定性，或稱重現(xiàn)性 重復數(shù),減少干擾因素對實驗的影響,動物方面 品種、年齡、性別、飼養(yǎng)（條件）等 儀器方面 靈敏度、精確度、操作熟練程度等 藥物方面 批次、純度、劑量、注射速度等 環(huán)境方面 溫度、濕度、氣壓等氣候因素,重復數(shù)與重現(xiàn)性的辯證關系,只有

6、足夠的重復數(shù)才能取得較高的重現(xiàn)性； 為達到某一重現(xiàn)性，必須有相應的適當?shù)闹貜蛿?shù)。,重復數(shù)的數(shù)量與質量的辯證關系,數(shù)量是保證重現(xiàn)性的基礎 質量是保證實驗能夠重復的重要條件 應盡量采用精密準確的實驗技術，減少實驗誤差，保證重復實驗在相同條件下進行。,相同條件,同時 同地 實驗條件 同條件 同種（相同種屬品系的動物） 同批（同一廠家生產的同批號樣品） 材料條件 同病情（病理模型）,實驗條件嚴密性與代表性的辯證關系,實驗條件控制越嚴密，個體差異越小，越有利于獲得準確的結論； 條件控制的過于嚴密，實驗結果的代表性就差，所得結論的適用范圍和重現(xiàn)范圍會受到限制。 在重復原則中，存在典型性和代表性或普遍性的關

7、系。,（二）隨機,實際意義 使每個實驗對象在接受處理時，有相等的機會，以減少主觀因素的影響，減少或避免偏性誤差，不隨機即有系統(tǒng)誤差，顯著性檢驗就無意義。 隨機不是隨便 隨機必須按隨機原則采用隨機數(shù)字表，以保證實驗對象分組的機會相等，隨便分組不可能達到每個實驗對象機會均等。,絕對隨機與均衡隨機,絕對隨機 又稱完全隨機，用于例數(shù)較多時優(yōu)越性較大; 均衡隨機 先將能控制的主要因素均衡分檔，再在每一檔中隨機取出等量動物分配到各組，使較難控制的因素得到隨機安排。,（三）對照,對照是比較的基礎，沒有對照就沒有比較和 鑒別，就談不上定量研究 自身對照 減少個體差異 組間對照 藥理實驗中最為常用 其他對照 正

8、常值對照 文獻值對照,組間對照,空白對照 不給藥，不作任何處理 實驗對照 不給藥，處理同實驗組 陽性對照 給予同類藥物或已知標準品 模型對照,陰性對照,不含研究中處理因素的對照組 空白對照 不給任何處理的對照 假處理對照 經同樣的麻醉、注射，但不進行關鍵處理 安慰劑 避免心理狀態(tài)對藥效的影響,陽性對照,藥物對照 用已肯定療效的藥物作對照，應為陽性結果 標準品對照 用標準藥物或典型藥物作為對照，目的是提供對比標準，以評定藥物效價 弱陽性對照 用常規(guī)療法或老藥、老療法、老方案對照,四、實驗程序,1. 實驗動物的選擇 種屬差異 品系差異 性別差異 2. 給藥方法 3. 實驗水平（機體水平） 粗分：整

9、體、離體；細分：分子、（亞）細胞、組織、器官、整體動物等。 4. 正常動物和模型動物實驗 5. 預防實驗和治療實驗 6. 比較試驗,五、藥效評價標準,1. 藥效評價的定量方法 量-效關系分析 為基本分析 量反應的量-效關系 劑量與效應 質反應的量-效關系 劑量與藥效反應率 時反應的量-效關系 劑量與潛伏期或持續(xù)期 時-效關系分析 藥效經時變化的動態(tài)規(guī)律 構-效關系分析 結構與藥效 藥-靶關系分析 與酶、受體、蛋白質、載體、膜通道等的關系,2. 藥物作用強度與量-效關系 3. 藥物作用持續(xù)時間與時效關系 藥物作用時間包括起效時間和持續(xù)時間。 比較藥物作用強度 用達到最大作用時的作用強度為指標；

10、比較作用出現(xiàn)時間 用達到最大作用的時間為指標； 比較作用持續(xù)時間 用消除速率或實際作用延續(xù)時間為指標； 用作用-時間曲線下面積作為綜合評價指標，既考慮到作用最大值，又考慮到作用持續(xù)時間。,六、實驗樣本數(shù),影響實驗樣本數(shù)的因素 藥物效果：藥效強，例數(shù)可相應減少 生物差異：個體差異小，標準差小，可少 實驗技術：實驗手段、儀器和設備嚴格精密，可少 統(tǒng)計處理：可提高實驗效率 兩組例數(shù)相等時，總例數(shù)可適當減少 計量比計數(shù)資料實驗效率高 同體實驗比分組實驗實驗效率高 特殊的實驗設計實驗效率高： 拉丁方、正交、交叉等，效率高，信息多，優(yōu)先采用,藥理實驗的基本例數(shù) 按統(tǒng)計學規(guī)定的P0.05及P0.01和藥理專

11、業(yè)上的實際例數(shù)習慣性規(guī)定，確定基本例數(shù)。 小動物 1030例 （計量10，計數(shù)30） 中等動物 820例 大動物 515例,七、實驗劑量的確定,安全劑量的探索 由該藥與已知藥物的效價比值推算 由劑量折算系數(shù)法計算,七、實驗劑量的確定,劑量遞增方案： 應用開始試用量（ds）后，如未出現(xiàn)療效，也未出現(xiàn)任何不良反應，則按下述方案遞增：對于動物實驗，按ds、2ds、3.3ds遞增，24次可達到預期量，以后均按增長率3033遞增。,多劑量實驗中劑量間距的確定,整體動物實驗 1:3:9 或 1:2:4:8（3或2倍遞增），太小，相鄰組藥效倒置；太大，藥效易處于S形曲線平坦處，不利于對比分析 離體器官實驗

12、1 : 10:100 :1000（10倍遞增） 計算 LD50或ED50的實驗 要求0及100之間有36個劑量組，量反應資料取1：0.11：0.5的組間比值，質反應資料取1：0.61：0.85的組間比值,按體表面積計算 A=K(W2/3/10000) A：體表面積（m2） W：體重(g) K：體表面積系數(shù),人與動物及各類動物間藥物劑量的換算,如：某藥大鼠劑量為250mg/kg，問犬的給藥劑量？ （假設一般實驗大鼠0.2 kg，實驗犬10 kg） 算大鼠體表面積：A=0.031 m2 將mg/kg 劑量換算為mg/ m2劑量： （250mg/kg 0.2 kg）/ 0.031 m2=1608 m

13、g/ m2 算犬體表面積： A=0.5198m2 算犬給藥劑量： 1608 mg/ m2 0.5198m2 /10 kg =84 mg/kg,按體型系數(shù)換算 dA=dBRA/RB（wA/wB）1/3 dA和dB分別是A、B兩種動物的每kg體重劑量（mg/kg) RA和RB分別是A、B兩種動物的體型系數(shù) wA和wB分別是A、B兩種動物的體重,八、實驗的穩(wěn)定性和靈敏度 及其實驗誤差的控制,實驗的穩(wěn)定性,影響因素 樣本的代表性 如年齡與體重 分組上的差異 體重、年齡、健康狀況等不同，分組不均勻，反應性差別明顯 實驗條件 時間、溫度、操作誤差等 實驗順序 給藥順序、交叉順序,表示方法,用變異系數(shù)（CV

14、） 或 相對標準差（RSD）表示。 CV越小，實驗波動越小，穩(wěn)定性越好。 CV0.05 穩(wěn)定性好 CV0.3 波動較大，應改進實驗方法或更換測量指標。,提高穩(wěn)定性的基本原則,從實踐和理論上認識受試藥物對所用實驗動物的生物反應差異性的規(guī)律： 實驗的專屬性 即反應指標在多大程度上體現(xiàn)藥物的作用強度 研究劑量-效應關系，應該選擇劑量與效應的直線范圍寬、劑量增減一定程度后效應增減幅度較明顯、相同劑量各次反應之間差異較小的實驗方法、模型和指標；,調整樣本數(shù) 生物差異大的實驗，用較多的動物，以提高實驗的準確性； 加強實驗條件的控制 動物條件：年齡、體重、性別和窩別一致 實驗設計方法：合適，以減少實驗誤差,

15、實驗方法的反應類型 量反應或直接測定最小數(shù)量，信息量大 質反應 信息量小 統(tǒng)計方法的應用 刪除、舍棄由于不正常操作或某些難以預測的因素的影響 重復實驗、合并計算等手段提高實驗結果的正確性,實驗的靈敏性,意義：考察藥效方法或模型對藥物劑量變化的敏感程度的一項指標。 影響因素： 模型或方法的選擇 實驗動物 年齡、性別、健康狀況 實驗設計 量效曲線1684 表示方法：因變系數(shù),因變系數(shù),因變系數(shù)即回歸系數(shù)或回歸線斜度,實驗誤差控制,誤差： 指非設計因素帶來的使標準差增大的所有差異 認識誤差來源從而控制誤差,誤差來源,1. 抽樣誤差 存在于任何實驗，是實驗中的重要誤差。 控制方法： 一定數(shù)量的樣本數(shù)

16、重復實驗 隨機化 使樣本具有代表性,2. 非均勻性誤差 主要由樣本代表性誤差所造成，因樣本不是來 源于均勻總體，僅在某一范圍內抽樣。 控制方法：分層隨機法分組，既可得到總平均值，又可得到各層平均值。 3. 分配誤差 發(fā)生在將樣本個體分配在一定空間及不同性質的組內。 控制方法：隨機化是唯一消除的方法。,4. 條件誤差 影響因素：時間、溫度、濕度、氣壓、儀器的穩(wěn)定性和靈敏度、操作者技術水平和熟練程度、實驗動物的狀況等。 控制方法：對照、隨機 5. 順序誤差 是特殊形式的條件誤差，發(fā)生在實驗進行時。 控制方法：在任何順序中均應采用隨機化，無法隨機時，采用對照與實驗個體交叉設計。,6. 估計誤差 是主

17、觀誤差，由實驗者的主觀愿望所造成， 搜集材料、測定數(shù)據(jù)偏向有利實驗結果的方向 控制方法： 實驗者必須有實事求是、嚴謹?shù)墓ぷ髯黠L； 盡可能采用現(xiàn)代化、自動化的實驗儀器，讓儀器作出準確的紀錄。,九、實驗數(shù)據(jù)的整理與處理,1. 讀 數(shù),數(shù)據(jù)計算和取值遵循有效數(shù)字法則及數(shù)字修約規(guī)則。,精密度：儀表的最小刻度稱為儀器的精密度。讀數(shù)時，由儀表最小刻度值向下估讀一位，數(shù)據(jù)最末位允許上下一個單位的誤差。 存疑數(shù)字：指最后一位估讀的數(shù)字 有效數(shù)字：數(shù)字中決定數(shù)量大小的有意義的數(shù)字，即由數(shù)字左側第一個非零數(shù)字開始直到最后包括0在內的數(shù)字。與儀器的靈敏度有關，反映數(shù)據(jù)的測量誤差,有效數(shù)字與儀器精密度,有效數(shù)字：儀器

18、最小刻度是準確的，前面的準確數(shù)字和末位的存疑數(shù)字統(tǒng)稱有效數(shù)字。 要求： 根據(jù)儀器實際具有的精密度正確讀數(shù)、正確記錄實驗結果的有效數(shù)字，多讀和少讀均是錯誤的。 計算過程中允許多保留一位有效數(shù)字，但結果必須按規(guī)定修約。,例如： 稱取小鼠的體重是21.4g，表示體重的真值在21.3521.45g之間，其中，21g是準確的，4 是估計的，3個數(shù)字均有意義，因此該數(shù)據(jù)的有效數(shù)字是3位。,2. 有效數(shù)字與誤差傳遞,稱取 指用分析天平稱量，精密度為0.1g 精密稱取或準確稱取 指用微量天平稱取，其精密度為 0.0001g,“0”在數(shù)字中的雙重性,數(shù)據(jù)左側的0起定位作用，僅表示小數(shù)點位數(shù)，不是有效數(shù)字，如0.

19、0214 數(shù)據(jù)右側的0，即數(shù)字末尾的0是有效數(shù)字，不能舍去，如21.40 在儀器中，數(shù)字末尾的0表示儀器的精密度，且有1個單位的誤差。如0.0618與0.06180，前者為0.000 1，后者為0.000 01。,誤差傳遞規(guī)律加減計算,得數(shù)的最大絕對誤差是各實測值絕對誤差之和。 加減得數(shù)的小數(shù)位數(shù)等于或小于實測值中最少的小數(shù)位數(shù) 如 8.340.03561.1007.2756 最大絕對誤差是 0.01+0.0001+0.0010.0111 取舍為 7.2756 7.28,誤差傳遞規(guī)律乘除計算,積商的最大相對誤差是各實測值相對誤差之和。 乘除得數(shù)的有效位數(shù)等于或小于實測值中最少的有效位數(shù)。,如

20、藥物 800.0mg , 藥液容量50.00mL，動物體重19.5g(0.0195kg)，注射用量0.68mL，則： 用藥量為（800.0mg /50.00mL)(0.68mL/0.0195kg)=557.95mg/kg 最大相對誤差為0.1/800.0+0.01/50.00+0.01/0.68 +0.0001/0.0195=0.02016=2.016% 最大誤差 557.952.01611.25mg/kg 用藥劑量應為 0.56g/kg 不能寫為560mg/kg，因560有三位有效數(shù)字,誤差傳遞規(guī)律乘方開方計算,乘方開方計算值的有效位數(shù)與原有效位數(shù)相同,誤差傳遞規(guī)律對數(shù)反對數(shù)計算,對數(shù)反對數(shù)計算值的有效位數(shù)與實測值相同，但對數(shù)的整數(shù)部分（首數(shù)）不算有效數(shù)字，不參與計算 即對數(shù)尾數(shù)的有效數(shù)字與實測值相同。 如：log27.21.43461.435,誤差傳遞規(guī)律均數(shù)及標準差計算,均數(shù)由許多實測值組成，其絕對誤差大于各實測值 一般規(guī)定均數(shù)標準差的有效位數(shù)，應根據(jù)1/3 標準差的第一位數(shù)取舍。