1、第六章 熒光分光光度法,基本要求： 了解熒光光譜法的基本原理和應(yīng)用特點(diǎn)。了解熒光分光光度計(jì)的組成以及特點(diǎn)。掌握熒光光譜法的定量分析方法。了解影響熒光強(qiáng)度的因素。,第一節(jié) 概論,回顧：,四大類,一、應(yīng)用：,1.定量分析 能產(chǎn)生熒光 或能形成熒光配合物的物質(zhì)。 2.簡單定性 回答“是不是”。,二、特點(diǎn)：,靈敏度高，比吸收光譜法高10104倍。ppb 選擇性比吸收光譜法好。,第二節(jié) 基本原理,一、分子熒光的產(chǎn)生 物質(zhì)吸收光輻射 價(jià)電子從基態(tài)躍到激發(fā)態(tài)，然后再回到基態(tài) 釋放能量以熱能的形式。以光輻射的形式。以光輻射形式釋放能量時(shí)，發(fā)射熒光。這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。,最常見的光致發(fā)光：熒光和磷光。 兩者發(fā)

2、光機(jī)理不同，壽命不同。熒光壽命10-910-6秒，磷光壽命10-310秒。 熒光可由激發(fā)態(tài)的分子產(chǎn)生，也可由激發(fā)態(tài)的原子產(chǎn)生，本章介紹分子熒光。 由于熒光的產(chǎn)生由價(jià)電子引起，所以，熒光光譜屬于電子光譜，其波長范圍位于：紫外光區(qū)和可見光區(qū)。,二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜, 激發(fā)光譜 固定熒光波長，以激發(fā)光波長對(duì)熒光強(qiáng)度(F)所作的光譜曲線。, 發(fā)射光譜 固定激發(fā)光波長，以熒光波長對(duì)熒光強(qiáng)度F所作的光譜曲線。,三、分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,分子要產(chǎn)生熒光，首先要能吸收紫外光或可見光。,能產(chǎn)生熒光的分子具有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：,【例】,芴具有剛性平面，產(chǎn)生的熒光比聯(lián)二苯強(qiáng)。,四、熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系,：量子效率，

3、發(fā)射光量子與吸收光量子之比。 I0：入射光強(qiáng)度 ：摩爾吸光系數(shù) b： 光程 c：濃度,F=2.303I0bc,公式成立前提條件：bc=A0.05 即：當(dāng)試樣濃度較低時(shí)（c0.05/b），C與F方成線性。（如果濃度過高，分子碰撞機(jī)會(huì)增大，而產(chǎn)生無輻射去激活，造成線性偏離。）,第三節(jié) 熒光分光光度計(jì),一、基本結(jié)構(gòu)示意圖,特點(diǎn)：1 光源方向與檢測方向成直角； 2 二個(gè)單色器。,二、主要部件及功能,1光源 高壓汞蒸氣燈，氙燈。 能提供紫外光和可見光，光強(qiáng)度比紫外-可見光分光光度計(jì)光源大得多。 2激發(fā)光單色器 作用：提供單波長的激發(fā)光。 色散元件：棱鏡或光柵。 出射狹縫寬度可調(diào) 。,3樣品池 須用石英材

4、料制成。 4熒光單色器 將樣品池中的散射光、反射光、雜質(zhì)熒光等濾掉，只讓熒光通過。 出射狹縫寬度可調(diào)。 5檢測器 光電轉(zhuǎn)換元件，測定熒光的強(qiáng)度。 檢測方向與激發(fā)光方向垂直：在垂直方向上沒有透過光的干擾。 由于熒光的強(qiáng)度較弱，一般以光電倍增管作檢測器。,第四節(jié) 定量分析,一、定量方法 一般采用工作直線法。作CF直線。,配制一系列待測成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液 C1 C2 C3 C4 C5 測出相應(yīng)的熒光強(qiáng)度 F1 F2 F3 F4 F5 建立工作直線（ F C） 作圖法 回歸法 測量待測樣品，得F樣 從工作直線上找到待測成分的濃度C樣 由回歸方程計(jì)算出C樣,二、影響熒光強(qiáng)度測定的因素,1激發(fā)光照射 有一些熒

5、光物質(zhì)若受到強(qiáng)光照射，會(huì)發(fā)生分解而導(dǎo)致F。 所以，熒光分光光度計(jì)通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在 測定時(shí)才打開光閘讓激發(fā)光照射樣品池。 2溫度 溫度，熒光效率下降，F(xiàn)。（因?yàn)?，溫度，增加分子間 碰撞機(jī)會(huì)而使能量消耗掉。）,4溶劑 有些溶劑會(huì)使熒光效率下降，也可能帶來干擾熒光。,所以，有時(shí)需要pH緩沖液控制pH值在適當(dāng)范圍內(nèi)。,3pH值 pH值能改變某些熒光物質(zhì)的電子構(gòu)型從而影響熒光強(qiáng)度。,靈敏度高?？筛哌_(dá)ppb級(jí)（10-9），甚至ppt級(jí)（10-12）。 選擇性好，與能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)少有關(guān)。,三、定量分析的特點(diǎn)及應(yīng)用,思考題,一、概念 （熒光）激發(fā)光譜 （熒光）發(fā)射光譜,二、問答題 試述分子熒光產(chǎn)生的過程。 試述分子熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系式，并說明公式成立的前提條件及原因。 分別說明熒光分光光度計(jì)兩個(gè)單色器的作用，以及將光路設(shè)計(jì)成直角方向的原因。 為什么可見光分光光度計(jì)的光路是直線方向，而熒光分光光度計(jì)的光路是直角方向？,熒光分析的激發(fā)