1、血流感染實(shí)驗(yàn)室診斷新進(jìn)展,北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科 王瑤 2013年4月13日,內(nèi)容,什么是血流感染？ 血流感染流行病學(xué)特點(diǎn) 血培養(yǎng)流程優(yōu)化 提高陽(yáng)性率 分析培養(yǎng)結(jié)果 減少污染 分子生物學(xué)方法檢測(cè)血流感染 基于PCR的技術(shù) MALDI-TOF MS PNA-FISH,概念,感染炎癥+病原體 全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS） 體溫38C或90次/分 呼吸頻率20次/分，或PaCO212109/L或10% 膿毒血癥（sepsis）感染+SIRS，血培養(yǎng)可以陽(yáng)性或陰性 重度膿毒血癥（severe sepsis）sepsis+臟器功能障礙、組織灌注不良和低血壓 感染性休克（septic shock）,概念,敗

2、血癥（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的臨床綜合征，是一種嚴(yán)重的全身感染。病原菌主要是細(xì)菌，也可為真菌、分枝桿菌等。 菌血癥（bacteremia）：細(xì)菌在血流中短暫出現(xiàn)的現(xiàn)象，一般無(wú)明顯毒血癥狀，在國(guó)外文獻(xiàn)中常與敗血癥通用。 血流感染（bloodstream infection, BSI）：敗血癥和菌血癥目前統(tǒng)稱為血流感染。,血流感染,醫(yī)院獲得性血流感染 原發(fā)血流感染 實(shí)驗(yàn)室證實(shí)血流感染（Laboratory-confirmed Bloodstream Infection, LCBI） 臨床血流感染（Clinical Sepsis） 繼發(fā)血流感染：血培養(yǎng)分離出有意義微生物

3、，而且此微生物與另一部位之院內(nèi)感染有關(guān)。唯不包括血管或血管內(nèi)導(dǎo)管裝置所引起之血流感染。 社區(qū)獲得性血流感染,實(shí)驗(yàn)室證實(shí)血流感染（LCBI）,標(biāo)準(zhǔn)一：從一次或多次血標(biāo)本中培養(yǎng)出一種一致的致病菌，而且培養(yǎng)出的病原體與其它部位的感染無(wú)關(guān)。 標(biāo)準(zhǔn)二：病人至少具有下列癥狀和體征之一：發(fā)熱（38 C ），寒顫或低血壓，并致病符合下列之一： 1.從兩次或兩次以上不同部位抽血的標(biāo)本中培養(yǎng)出皮膚寄生菌（如類白喉?xiàng)U菌、芽孢桿菌、丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌或微球菌）。 2.至少一次從帶血管內(nèi)導(dǎo)管的病人血標(biāo)本中培養(yǎng)出皮膚寄生菌群（如類白喉?xiàng)U菌、芽孢桿菌、丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌或微球菌），并且主管醫(yī)生開始了適當(dāng)

4、的抗菌藥物治療。 3.血中抗原檢測(cè)陽(yáng)性（如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌或B群鏈球菌）。與實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性結(jié)果一致的癥狀和體征與其它部位的感染無(wú)關(guān)。 標(biāo)準(zhǔn)三：年齡38 C ），低溫（37 C ），呼吸暫停、脈搏徐緩，并具有下列之一（同上3點(diǎn)略）,臨床血流感染（Clinical Sepsis）,具有下列二條件之一者： 具有非其它已知原因所引起的發(fā)燒、血壓過(guò)低（收縮壓90mmHg或收縮壓低于平常超過(guò)40mmHg），少尿（每小時(shí)尿量低于30ml）等臨床癥狀任何一項(xiàng)，且符合下列所有條件者： 未做血培養(yǎng)，或血培養(yǎng)陰性或血液抗原反應(yīng)呈陰性者 其它部位無(wú)明顯感染者 醫(yī)生針對(duì)此感染中毒癥狀給予適當(dāng)抗菌藥物治

5、療 1歲以下嬰兒 ，具有非其它書籍原因引起的發(fā)燒、體溫過(guò)低、呼吸中止或心跳過(guò)緩等臨床癥狀任何一項(xiàng)，且符合下列所有條件者： 未做血培養(yǎng)，或血培養(yǎng)陰性或血液抗原反應(yīng)呈陰性者 其它部位無(wú)明顯感染者 醫(yī)生針對(duì)此感染中毒癥狀給予適當(dāng)抗菌藥物治療,BSI流行病學(xué)特點(diǎn),BSI發(fā)病率逐年增加 凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌、真菌血流感染發(fā)病率逐年上升，革蘭陰性菌下降 耐藥菌比例逐年增加 社區(qū)獲得與醫(yī)院獲得血流感染病原譜存在差異 院內(nèi)BSI患者病死率高,美國(guó)膿毒血癥流行病學(xué),Martin et al, NEJM 2003;348:1546,加拿大CANWORD監(jiān)測(cè)2002-2009,Diag Microbiolo

6、Infect Dis. 2011; 69: 307,加拿大CANWORD監(jiān)測(cè)2002-2009,Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 307,美國(guó)49醫(yī)院BSI病原譜,CID. 2004, 39: 309-317,PUMCH2012年834血培養(yǎng)分離株,PUMCH2012年144株BSI大腸埃希菌藥敏結(jié)果,ESBL 60.2%,PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌藥敏結(jié)果,ESBL 34.4%,PUMCH2012年61株BSI鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏結(jié)果,PUMCH2012年76株BSI金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果,PUMCH2012年46株BSI草綠色溶血鏈球

7、菌藥敏結(jié)果,2011CHIF-NET489株BSI酵母菌,2011CHIF-NET念珠菌對(duì)氟康唑的敏感性,2011CHIF-NET念珠菌對(duì)伏立康唑的 敏感性,2011CHIF-NET其他酵母菌對(duì)氟康唑的敏感性,2011CHIF-NET其他酵母菌對(duì)伏立康唑的 敏感性,采血量是影響血培養(yǎng)陽(yáng)性率的獨(dú)立相關(guān)因素,CLSI M47-A：每位患者采集23套血培養(yǎng)（4060ml） Surviving Sepsis Campaign Guidelines (Worldwide)：抗菌藥物治療前至少采集2套血培養(yǎng) 英國(guó)NHS血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)：采集2套血培養(yǎng),采血量對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性率的影響,JCM 2007,采血量對(duì)血培養(yǎng)

8、陽(yáng)性率的影響,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,Routine Set Mayo Clinic: 2 BACTEC Aerobic Plus Bottles + 1 BACTEC Anaerobic Lytic Bottle,采血量和陽(yáng)性率,27,非條件致病菌,28,在多次血培養(yǎng)中單次培養(yǎng)下列細(xì)菌陽(yáng)性 凝固酶陰性葡萄球菌 棒狀桿菌 微球菌 丙酸桿菌 芽孢桿菌 如多次培養(yǎng)陽(yáng)性，可能為條件致病菌，需結(jié)合臨床分析,血培養(yǎng)污染菌,非條件致病菌,Mayo Clinic,(p0.001),

9、為什么需氧+厭氧？,29,Pathogen No.,兩種組合均能檢測(cè),不同的病原菌,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,表皮葡萄球菌血培養(yǎng)陽(yáng)性意義,CID 1997,血培養(yǎng)陽(yáng)性時(shí)間凝固酶陰性葡萄球菌,96%(+) 86%單瓶（）,需氧瓶242 厭氧瓶72 需厭150,血培養(yǎng)陽(yáng)性時(shí)間金黃色葡萄球菌,如何分析血培養(yǎng)凝固酶陰性葡萄球菌？,University Hospital of Base，20032007 3060陽(yáng)性血培養(yǎng)，654CNS，粒缺患者除外 232 (35%)真正BSI，422 (65%)污染 BSI由感染科醫(yī)生判斷，至少一份血培養(yǎng)CNS陽(yáng)性，

10、有感染臨床表現(xiàn) SIRS: 體溫38C or 90/min; 呼吸 20/min; 白細(xì)胞12 or 10% 未成熟中性粒細(xì)胞 32%患者有1瓶以上CNS陽(yáng)性，BSI68 %，污染12% (p 0.001) 沒有SIRS癥狀：BSI 5%，污染29% (p 0.001),Clin Microbiol Infect. 2012 online,單瓶血培養(yǎng)CNS的BSI和污染患者區(qū)別,Clin Microbiol Infect. 2012 online,單瓶血培養(yǎng)CNS陽(yáng)性BSI與臨床癥狀相關(guān)性,Clin Microbiol Infect. 2012 online,Clin Microbiol In

11、fect. 2012 online,降低血培養(yǎng)污染率嚴(yán)格消毒,血培養(yǎng)瓶消毒：70%酒精消毒血培養(yǎng)瓶橡皮塞,待干60秒?；?0%異丙醇消毒干燥 皮膚消毒： 三步法 70%酒精擦拭靜脈穿刺點(diǎn) 30秒 1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒：從穿刺點(diǎn)向外畫圈消毒,直徑3cm 70%酒精脫碘 一步法 葡萄糖酸洗必泰作用30 s，或70%異丙醇消毒后自然干燥，但不適用于2個(gè)月以內(nèi)的新生兒。,急診血培養(yǎng)污染率與工作量相關(guān),The University of Michigan Health System急診 血培養(yǎng)大多數(shù)由采血員采集，其次為護(hù)士和醫(yī)生 采血員:病人= 1:9，重癥區(qū)護(hù)士:病人= 2:3，其

12、它區(qū)域護(hù)士:病人=1:4 年病人量82521人，采集血培養(yǎng)者7586人 11.4%至少1瓶陽(yáng)性，病原菌陽(yáng)性率8.0%，污染率3.7% 多套培養(yǎng)患者陽(yáng)性率7.4%，單套培養(yǎng)陽(yáng)性率5.1%（p0.001），污染率無(wú)顯著差別（2.2% vs. 2.6%）,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,急診小時(shí)工作量,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,繁忙時(shí)血培養(yǎng)污染率增加,OR=1.23,OR=0.93,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,抗菌藥物治療與

13、血流感染死亡率,死亡率,Chest 115 (2): 1999,血培養(yǎng)三級(jí)報(bào)告制度,血培養(yǎng) 陽(yáng)性,終報(bào)告,革蘭染色,傳種培養(yǎng),初步報(bào)告 (直接藥敏),鑒定菌株,電話報(bào)告,鑒定標(biāo)準(zhǔn)藥敏,42,血培養(yǎng)結(jié)果回報(bào)對(duì)治療的影響,A = Appropriate Therapy(正確治療) I = Inappropriate Therapy(不正確治療),Clin Infec Dis 24:584-602, 1997,血流感染快速分子診斷,分子診斷不受抗菌藥物使用的影響 血培養(yǎng)陽(yáng)性后分子診斷 直接使用血標(biāo)本進(jìn)行分子診斷 快速 但不能提供藥敏結(jié)果,血培養(yǎng)陽(yáng)性瓶分子鑒定,Antigone Kotsaki, et

14、 al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209,陽(yáng)性血培養(yǎng)基于PCR的檢測(cè),PCR特異性檢測(cè) 病原特異性PCR 特定耐藥基因檢測(cè)：葡萄球菌mecA, 腸球菌van 細(xì)菌載量：肺炎鏈球菌自溶毒A基因lytA拷貝數(shù) 廣譜檢測(cè)：PCR擴(kuò)增特定靶位 多態(tài)性分析 測(cè)序 后續(xù)基因檢測(cè) 種特異性real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis.2011, 24(2):137,qPCR鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性瓶中銅綠假單胞菌,Target：ecfX gene 血培養(yǎng)系統(tǒng)：Bac

15、T/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均顯示G-b 對(duì)照方法：氧化酶，API 20E DNA提取：0.5ml肉湯，離心后加裂解液，水煮法 定量PCR： 擴(kuò)增：Oligonucleotide primers 基因特異性檢測(cè)：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragment,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,47,qPCR鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性瓶中銅綠假單胞菌,33瓶pae，敏感性和特異性均為100% 1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)kpn (108CFU/ml)，P

16、CR(-) 檢測(cè)限：將ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,48,陽(yáng)性血培養(yǎng)基于PCR的檢測(cè),最常見病原體多重PCR 電泳譜、ELISA雜交、多重Real-time PCR Hyplex BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成 Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：多重real-time PCR+微陣列分析，檢測(cè)多種病原及mecA，3h完成 多重Real-ti

17、me PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.,血培養(yǎng)陽(yáng)性多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培養(yǎng)陽(yáng)性多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培養(yǎng)陽(yáng)性PNA FISH核酸熒光原位雜交,血培養(yǎng)陽(yáng)性肉湯革蘭染色PNA FISH,革蘭陰性菌： 商品化試劑盒eco/kpn/pae Efa/其它腸球 Sau/scn Cal/cgl/其它念珠菌 報(bào)道Salmonella spp. 90min PNA FISH完成,Appl

18、Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301 J Clin Microbiol. 2009; 47: 247,52,MALDI-TOF MS,基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI） 原理：將樣品分散在基質(zhì)分子中形成結(jié)晶后直接進(jìn)樣，當(dāng)用激光照射結(jié)晶時(shí)，基質(zhì)吸收了激光的大部分能量，使基質(zhì)分子和樣品獲得能量投射到氣相并得到電離，成為帶電荷的離子。 基質(zhì)在樣品離子形成過(guò)程中起到了質(zhì)子化或去質(zhì)子化的作用，使樣品帶上正電荷或負(fù)電荷，成為帶電荷的離子 基質(zhì)會(huì)干擾被檢測(cè)分子質(zhì)譜峰的大小和濃度；不同類型的分析物選擇不同的基

19、質(zhì),MALDI-TOF MS,飛行時(shí)間（TOF） 原理：離子源產(chǎn)生的離子在加速電場(chǎng)獲得動(dòng)能，當(dāng)進(jìn)入高真空無(wú)電場(chǎng)飛行管道并在此管道內(nèi)飛行時(shí)，質(zhì)量較輕的離子飛行速度快，早到達(dá)檢測(cè)器；質(zhì)量較重的離子飛行速度慢，晚到達(dá)檢測(cè)器。因此依據(jù)離子的飛行時(shí)間與其質(zhì)荷比平方根（m/z）成正比的關(guān)系，通過(guò)測(cè)定飛行時(shí)間，計(jì)算出相應(yīng)離子的分子量。,MALDI-TOF MS操作步驟,MALDI-TOF MS快速鑒定陽(yáng)性血培養(yǎng),使用菌落、陽(yáng)性血培養(yǎng)肉湯鑒定 快速：20分鐘(從報(bào)警到鑒定出結(jié)果） MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD): 正確鑒定：193/213陰性菌（包括厭氧菌）(90.61%)，2

20、84/319陽(yáng)性菌(89.02%) 80.9%復(fù)數(shù)菌正確鑒定出一種，7株緩癥鏈球菌鑒定為spn MALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMrieux): 388個(gè)陽(yáng)性瓶，種正確率91%（包括念珠、厭氧菌） 15瓶復(fù)數(shù)菌：使用通用庫(kù)多鑒定出一種，革蘭染色后使用陰性或陽(yáng)性庫(kù)分析，6瓶鑒定出第二種菌,Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631J Clin Microbiol 2010; 48: 1542,56,MALDI-TOF MS,VITEK MS(bioMrieux) 以16s為金標(biāo)準(zhǔn)，980株臨床分離株，ID正確率 腸桿菌科97.7

21、% 非發(fā)酵菌92% 葡萄球菌屬94.3% 鏈球菌屬84.8% HACEK84% 酵母菌85.2%,57,J Clin Microbiol. 2010; 48: 900,PCR/ESI MS,廣譜PCRESI MS（電噴射質(zhì)譜） 189陽(yáng)性血培養(yǎng)和45陰性血培養(yǎng)，種一致率98.7% 6例spn標(biāo)本方法陰性 提供定量結(jié)果評(píng)估病原體載量 假陰性率24%：幾乎均由混合感染導(dǎo)致 5-6h完成檢測(cè) 結(jié)合PCR的敏感性和ESI MS特異性 可以直接檢測(cè)標(biāo)本，不需要培養(yǎng),Proc Natl Acad Sci. 2005;102:8012,血標(biāo)本分子檢測(cè),種特異性、屬特異性、廣譜、多重PCR、微陣列分析 血培養(yǎng)

22、陰性的苛養(yǎng)菌，如Bartonella spp.巴爾通體, Coxiella burnetii伯氏考克斯體, Mycoplasma spp.支原體, Chlamydia spp.衣原體, Ricketssia spp.立克次體，Tropheryma whipplei,商品化分子生物學(xué)檢測(cè)方法:血標(biāo)本,SeptiFast(Roche)：multiplex real-time PCR，種屬特異性熒光探針，檢測(cè)重要血流感染致病菌 SepsiTestTM (Molzym)：eubacterial and panfungal real-time PCR， a 16S and 18S rRNA gene-based universal PCR+ sequencing，幾乎可以鑒定所有細(xì)菌、真菌 VYOO (SIRS Lab)：multiplex PCR，檢測(cè)重要血流感染菌，電泳分離擴(kuò)增片段 Plex-ID (Abbott)：eubacterial and panfungal PCR+質(zhì)譜，幾乎可以鑒定所有細(xì)菌、真菌,60,Intensive Care Med. 2011 May, publish online.,SeptiFast test檢測(cè)的病原譜,