1、種 子 擴(kuò) 大 培 養(yǎng),1、在空氣過(guò)濾除菌的過(guò)程中空氣儲(chǔ)罐的作用是 ，絲網(wǎng)除沫器的作用是 ?？諝饧訜嵩O(shè)備的作用 是 。 2、空氣過(guò)濾器按過(guò)濾介質(zhì)空隙大小分為 和 。 3、介質(zhì)孔隙大于被攔截的微生物大小，但介質(zhì)層有一定的厚度，機(jī)理是靜電、擴(kuò)散、慣性及攔截作用。 4、在實(shí)驗(yàn)室或中試規(guī)模，空氣過(guò)濾器只設(shè) 級(jí)，而大型發(fā)酵工廠大多采用 級(jí)過(guò)濾。 5、工廠發(fā)酵生產(chǎn)中棉花活性炭過(guò)濾器一般用作 ，金屬燒結(jié)管和微孔膜過(guò)濾器一般用作 。,緩沖空氣脈沖,除去 較小液滴,降低空氣的濕度,絕對(duì)過(guò)濾,深層過(guò)濾,一,二,總過(guò)濾器,分過(guò)濾器,1、連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣。VVM一般為0.12.0 m3 。 2、空氣的壓強(qiáng)(

2、表壓)為0.20.4 MPa。 3、進(jìn)入過(guò)濾器之前，空氣的相對(duì)濕度70。 4、進(jìn)入發(fā)酵罐的空氣溫度可比培養(yǎng)溫度高1030。 5、壓縮空氣的潔凈度，在設(shè)計(jì)空氣過(guò)濾器時(shí)，一般取失敗概率為10-3為指標(biāo)。,發(fā)酵用無(wú)菌空氣的基本要求,1、濕熱滅菌的條件是 。 2、發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌中， 方法對(duì)滅菌的蒸汽壓力要求高。在分批滅菌過(guò)程中要先 通過(guò) 進(jìn)行預(yù)熱，在通入蒸汽升溫到121。 3、連消的特點(diǎn)是 和 ，適合 發(fā)酵罐。,夾套或蛇管,121 30min,連續(xù)滅菌,快速,高溫,大型,對(duì)數(shù)穿透定律：,對(duì)數(shù)殘留定律,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)定律,比熱死速率,過(guò)濾常數(shù),比生長(zhǎng)速率,發(fā)酵工程的流程,空氣,空氣凈化處理,保藏菌種,斜面活化

3、,擴(kuò)大培養(yǎng),種子罐,發(fā)酵罐,培養(yǎng)基制備滅菌,滅菌,產(chǎn)物分離純化,成品,原料預(yù)處理,種 子 擴(kuò) 大 培 養(yǎng),現(xiàn)代的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模越來(lái)越大，每只發(fā)酵罐的容積有幾十立方米甚至幾百立方米，要使小小的微生物在幾十小時(shí)的較短時(shí)間內(nèi)，完成如此巨大的發(fā)酵轉(zhuǎn)化任務(wù)，那就必須具備數(shù)量巨大的微生物細(xì)胞才行。,一、概述,1、定義：菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)就是把保藏在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶和種子罐，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后達(dá)到一定的數(shù)量和質(zhì)量的純種培養(yǎng)過(guò)程。這些純種的培養(yǎng)物稱(chēng)為種子。,2、作為生產(chǎn)用種子的準(zhǔn)則,1）菌種細(xì)胞的生長(zhǎng)活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，延滯期短。,2）生理性

4、狀穩(wěn)定,3）菌體總量及濃度能滿(mǎn)足大容量發(fā)酵罐的要求,4）無(wú)雜菌污染,5）保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力,實(shí)驗(yàn)室種子制備階段 （一級(jí)種子培養(yǎng)）,生產(chǎn)車(chē)間種子制備階段 （二級(jí)種子培養(yǎng)、 三級(jí)種子培養(yǎng)） 二級(jí)發(fā)酵 三級(jí)發(fā)酵,砂土孢子,冷凍干燥孢子,斜面孢子,搖瓶液體培養(yǎng),茄子瓶斜面培養(yǎng),固體培養(yǎng)基培養(yǎng),一級(jí)種子罐,二級(jí)種子罐,發(fā)酵罐,二、種子制備工藝,生產(chǎn)菌種的制備 兩個(gè)過(guò)程：在固體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量孢子的孢子制備過(guò)程和在液體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量菌絲的種子制備過(guò)程 孢子的產(chǎn)生條件？,孢子制備 放線菌孢子的制備 工藝過(guò)程,注意事項(xiàng) 限制碳源(約1%)和氮源(不超過(guò)0.5%)； 培養(yǎng)溫度多為28 ，少數(shù)為37 ，培養(yǎng)時(shí)間

5、為514天； 采用孢子進(jìn)罐：工藝簡(jiǎn)單，批間差異小，便于控制孢子質(zhì)量；采用菌絲進(jìn)罐：可縮短種子罐內(nèi)的培養(yǎng)時(shí)間(尤適生長(zhǎng)緩慢的菌種)。,霉菌孢子的制備 注意事項(xiàng) 天然農(nóng)產(chǎn)品因具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)成分 和較大表面積而適合作霉菌的培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度多為2528 ，培養(yǎng)時(shí)間為414天,細(xì)菌孢子的制備 注意事項(xiàng) 1.適合采用碳源限量而氮源豐富的培養(yǎng)基 2.培養(yǎng)溫度多為37 ，少數(shù)為28 ，培養(yǎng)時(shí) 間細(xì)菌菌體為12天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌為510天,種子制備 概念：指將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基種培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過(guò)程。 搖瓶種子 種子罐種子,搖瓶種子制備 孢子發(fā)芽或菌絲繁殖緩慢的菌種需將

6、孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進(jìn)入種子罐，搖瓶具有濃縮種子罐的作用，其培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與種子罐相似。 種子培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)應(yīng)豐富完全，易被菌體利用，濃度不宜過(guò)高。,種子罐種子制備 A. 孢子或搖瓶菌絲被接入體積較小的種子罐中，培養(yǎng)后形成的大量菌絲，這種種子稱(chēng)為一級(jí)種子 把一級(jí)種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中發(fā)酵，稱(chēng)為二極發(fā)酵 種子罐的級(jí)數(shù)主要決定于菌種的性質(zhì)、菌體的生長(zhǎng)速度和發(fā)酵設(shè)備的合理應(yīng)用 種子罐級(jí)數(shù)減少，有利于生產(chǎn)過(guò)程的簡(jiǎn)化和發(fā)酵過(guò)程的控制，減少因種子生長(zhǎng)異常而造成的發(fā)酵波動(dòng),實(shí)驗(yàn)室種子制備階段： 瓊脂斜面 固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng) 搖瓶液體培養(yǎng),生產(chǎn)車(chē)間種子制備階段： 種子罐擴(kuò)大培養(yǎng),對(duì)接種物的一般要求：,1）應(yīng)以

7、高產(chǎn)菌株中分離獲得的純系作為出發(fā)菌株。菌株純度高，性狀穩(wěn)定，不易發(fā)生變異。 2）生理活性強(qiáng)。 若以菌體細(xì)胞為接種物，應(yīng)采取正在旺盛生長(zhǎng)的繁殖期細(xì)胞，菌體細(xì)胞應(yīng)均勻，同步率高。以孢子為接種物，應(yīng)采用易于萌發(fā)的孢子。,為了提高孢子的萌發(fā)率，有時(shí)需采取一些特殊措施 如： 丙酮丁醇梭菌的孢子在沸水中處理90秒后在放入液體培養(yǎng)基底部，可獲得較高的發(fā)芽率。 有的孢子不被水浸潤(rùn)，浮在液體培養(yǎng)基表面或貼在培養(yǎng)容器內(nèi)壁，不形成懸液?？稍谂囵B(yǎng)基中加入少量無(wú)毒的表面活性劑，幫助形成懸液。,1、實(shí)驗(yàn)室種子制備,對(duì)于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子；這樣操

8、作簡(jiǎn)便，不易污染雜菌。 如：檸檬酸生產(chǎn)的制種，用麩皮培養(yǎng)基產(chǎn)生大量孢子直接用于種子罐接種。,對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。 如：用灰色鏈霉菌生產(chǎn)鏈霉素 用卡那鏈霉菌生產(chǎn)卡那霉素,對(duì)于不產(chǎn)孢子的細(xì)菌，生產(chǎn)上一般采用將試管斜面菌種接入茄瓶斜面或搖瓶培養(yǎng)。 如：谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)谷氨酸,實(shí)驗(yàn)室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等。如果是需氧菌，同時(shí)還需供給足夠的無(wú)菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，

9、獲得相同的培養(yǎng)條件。,2、生產(chǎn)車(chē)間種子制備,2）種子罐的作用： 主要是使孢子發(fā)芽，生長(zhǎng)繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。,種子罐,2）種子罐級(jí)數(shù)的確定,種子罐級(jí)數(shù)是指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。,一般根據(jù)菌種生長(zhǎng)特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度以及所采用發(fā)酵罐的容積而定。,細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌：生長(zhǎng)較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵 孢子懸浮液一級(jí)種子罐（27C,40小時(shí)孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）二級(jí)種子罐（ 27C,1024小時(shí)，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐 放線菌：生長(zhǎng)更慢，采用四級(jí)發(fā)酵 酵母：比細(xì)菌慢

10、，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子,種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì)； 種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會(huì)；,確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問(wèn)題,對(duì)于生長(zhǎng)快的細(xì)菌，種子用量比例小，故種子罐相應(yīng)也少。 如： 谷氨酸生產(chǎn)中，采用茄瓶斜面或搖瓶種子接入種子罐于32培養(yǎng)710h，菌體濃度達(dá)108109個(gè)/ml，即可接入發(fā)酵罐作為種子。 這稱(chēng)為一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，也稱(chēng)二級(jí)發(fā)酵。,生長(zhǎng)較慢的菌種，如青霉素生產(chǎn)菌種，其孢子懸浮液接入一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)于27培養(yǎng)40h，此時(shí)孢子發(fā)芽，長(zhǎng)出短菌絲，再移至含有新鮮培養(yǎng)基的第二級(jí)種子罐，于27培養(yǎng)1024h，菌絲迅速繁殖，

11、獲粗壯菌體，即可移至發(fā)酵罐作為種子。 這稱(chēng)為二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，也稱(chēng)三級(jí)發(fā)酵。 一般50m3發(fā)酵罐都采用三級(jí)發(fā)酵,生長(zhǎng)更慢的菌種，鏈霉素生產(chǎn)菌種灰色鏈霉菌，一般采用三級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)（四級(jí)發(fā)酵）,在小型罐（5500L）中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常采用直接將孢子或菌絲體接入罐中發(fā)酵，這可稱(chēng)為一級(jí)發(fā)酵。,種子罐的級(jí)數(shù)越少，越有利于簡(jiǎn)化工藝和控制，并可減少由于多次移種而帶來(lái)的染菌的機(jī)會(huì)。,但也必須考慮盡量延長(zhǎng)發(fā)酵罐生產(chǎn)產(chǎn)物的時(shí)間，縮短由于種子發(fā)芽、生長(zhǎng)而占用的非生產(chǎn)時(shí)間，以提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。,雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定，但也與所選用工藝條件有關(guān)。 如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的

12、繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)。,種子罐1 發(fā)酵罐1 發(fā)酵罐2 種子罐2,移種方式：,1）單種 2）雙種 3）倒種 4）混種,1）單種：一個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。 2）雙種：為加大接種量，兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。 3）倒種：種子罐染菌又無(wú)備用種子時(shí)或種子質(zhì)量不理想可采樣倒種法，以適宜的發(fā)酵罐倒出部分給另一發(fā)酵罐。 4）混種：一部分種子來(lái)源于種子罐，一部分來(lái)源于發(fā)酵罐。,2）種齡,種齡種子罐中培養(yǎng)的菌體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。,選擇適當(dāng)種齡的菌種接種十分重要,通常，種齡以菌體處于生命力極為旺盛的對(duì)數(shù)期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達(dá)到最高峰時(shí)，較為合適。,過(guò)于年輕的種子接入

13、發(fā)酵罐后，往往會(huì)出現(xiàn)前期生長(zhǎng)緩慢、發(fā)酵周期延長(zhǎng)、產(chǎn)物開(kāi)始形成的時(shí)間推遲，造成異常發(fā)酵的情況。,過(guò)老的種子會(huì)引起生產(chǎn)能力下降，菌體過(guò)早自溶。,不同品種或同一品種的工藝條件不同，其菌齡也不一樣，一般要經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，考察其發(fā)酵罐中產(chǎn)量的多少來(lái)確定最適種齡。,嗜堿性芽孢桿菌種齡對(duì)產(chǎn)酶 （堿性蛋白酶）的影響,3）接種量,接種量是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。,大多數(shù)抗生素發(fā)酵的最適接種量為715%，有時(shí)可增加到20 25%；而由棒狀桿菌生產(chǎn)谷氨酸 接種量只需1%。,除了始于斜面培養(yǎng)的初次接種外，發(fā)酵過(guò)程的各階段接種量一般均需0.510%的接種量。,接種量的大小取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵中生長(zhǎng)繁殖

14、的速度。,采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌體繁殖到達(dá)高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來(lái)。,近年來(lái)，不少?gòu)S家以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)的措施；有的產(chǎn)品采用兩個(gè)種子罐接一個(gè)發(fā)酵罐的雙種法。 如卡那霉素生產(chǎn)中采用雙種比單種的發(fā)酵單位提高8%，且達(dá)到產(chǎn)量高峰的時(shí)間提前。,但如果接種量過(guò)大，往往使菌體生長(zhǎng)過(guò)快、培養(yǎng)液黏度增加，造成溶氧不足，從而影響產(chǎn)物的合成。 如由嗜堿芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶的發(fā)酵，1%接種量產(chǎn)酶活最高，在0.54%之間雖有差別，但影響不大；如超過(guò)4%則酶產(chǎn)量明顯下降。,3、種子質(zhì)量的判斷,為了保證各級(jí)種子移種前的質(zhì)量，除了保證規(guī)定的培養(yǎng)條件外，在過(guò)程中還要定期取樣測(cè)定一些

15、參數(shù)以觀察基質(zhì)的代謝變化及菌體形態(tài)是否正常。,1、細(xì)胞或菌體 菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀 單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； 霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對(duì)某些染料著色力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。,2、生化指標(biāo) 通常測(cè)定的參數(shù)有：,1）pH 2）培養(yǎng)基滅菌后磷、糖、氨基氮的含量變化 3）菌體形態(tài)、菌體濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等） 4）其它參數(shù)，如某種酶的活力,如土霉素發(fā)酵中，種子液的淀粉酶活力與發(fā)酵單位有一定關(guān)系，可通過(guò)測(cè)定種子液中淀粉酶的活力判斷種子質(zhì)量。,細(xì)菌菌體濃度的測(cè)量方法有 。 霉菌濃度的測(cè)量方法有 。 霉菌或放線菌孢子測(cè)量的方法

16、有 。,OD600,測(cè)干重,血球板計(jì)數(shù),稀釋平板計(jì)數(shù),測(cè)干重,離心測(cè)體積,血球板計(jì)數(shù),稀釋平板計(jì)數(shù),細(xì)菌培養(yǎng)溫度多為 ， 發(fā)酵。霉菌培養(yǎng)溫度多為 ， 發(fā)酵，放線菌培養(yǎng)溫度多為 。 發(fā)酵。酵母 發(fā)酵 A.25-28 B. 28 C. 37 A.二級(jí) B.三級(jí) C.四級(jí) 二級(jí)發(fā)酵,二級(jí),二級(jí),二級(jí),二級(jí),37,25-28,28,3、產(chǎn)物生成量 在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。,4、酶活力 種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。,種子異常分析,菌種生長(zhǎng)速度，過(guò)快或過(guò)慢 菌絲結(jié)團(tuán) 菌絲粘壁,影響孢子質(zhì)量 的

17、因素 及控制,培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件,培養(yǎng)時(shí)間 和 冷藏時(shí)間,三、影響種子質(zhì)量的因素,1、培養(yǎng)基,生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動(dòng)。,原材料質(zhì)量的波動(dòng)，起主要作用的是其中的無(wú)機(jī)離子含量不同。如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會(huì)影響孢子的質(zhì)量。,1、培養(yǎng)基,生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動(dòng)。,如： 四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對(duì)孢子質(zhì)量均有一定影響。 制備霉菌用的大米，其產(chǎn)地、顆粒大小、均勻程度不同，孢子質(zhì)量也不同。 蛋白胨加工原料

18、不同（如魚(yú)胨或骨胨）對(duì)孢子影響也不同。 水質(zhì)的硬度、污染程度對(duì)生產(chǎn)均有影響,水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動(dòng)，影響種子質(zhì)量。 菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類(lèi)型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類(lèi)型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。,措施 培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)合格才可使用 嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量 斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時(shí)間 供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源,2、培養(yǎng)條件,1）溫度,2）濕度,不同濕度對(duì)龜裂鏈霉菌（產(chǎn)土霉素）斜面生長(zhǎng)的影響 相對(duì)濕度 斜面外觀 活孢子數(shù)（108/支） 16.5

19、19 上部稀薄，下部稠，略黃 1.2 2536 上部薄，中部均勻，發(fā)白 2.3 4045 一片白，孢子豐富，稍皺 5.7,3）通氣量,一般需保證充足的通氣,溫度對(duì)多數(shù)品種斜面孢子 質(zhì)量有顯著影響。 如 ：土霉素生產(chǎn)種子，在高于37培養(yǎng)時(shí)，孢子接入發(fā)酵罐后表現(xiàn)出糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過(guò)早自溶，效價(jià)降低等。,制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對(duì)孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大影響。,3、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間,（1）培養(yǎng)時(shí)間 一般來(lái)說(shuō)，衰老的孢子不如年輕的孢子，因?yàn)樗ダ系逆咦右言谥鸩竭M(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過(guò)于衰老的孢子會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。 措施：孢子培養(yǎng)的時(shí)間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量

20、正常的階段終止培養(yǎng)。,（2）斜面冷藏時(shí)間,斜面冷藏對(duì)孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。 如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏78天菌體細(xì)胞開(kāi)始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。 冷藏時(shí)間對(duì)孢子的生產(chǎn)能力也有影響。 如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6冷藏2個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏1個(gè)月降低18%，冷藏3個(gè)月后降低35%。,4、接種量,接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進(jìn)而影響菌體的生理狀況。,影響種子質(zhì)量 的因素及控制,接種量,種齡,孢子的質(zhì)量,培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件,四、種子質(zhì)量的控制措施,1、培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要； 選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基

21、； 營(yíng)養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用； 營(yíng)養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高。 營(yíng)養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。,2、培養(yǎng)條件 （1）溫度 （2）通氣量: 在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。 例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過(guò)程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。 但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級(jí)種子罐的通氣量小對(duì)發(fā)酵有利。,3、種齡 種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。 通常種齡是以處于生命力極旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體量還未達(dá)到最大值時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間較為合適。

22、時(shí)間太長(zhǎng)，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長(zhǎng)緩慢。,不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過(guò)多種實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。 嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時(shí)最好。,4、接種量 接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。 接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來(lái)，并可減少雜菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)。,但接種量過(guò)大或者過(guò)小，均會(huì)影響發(fā)酵。過(guò)大會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會(huì)過(guò)多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過(guò)小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。 通常接種量，細(xì)菌15%，酵

23、母菌510%，霉菌715%、有時(shí)2025%。,種子質(zhì)量的控制措施,種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來(lái)的生產(chǎn)能力。 首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無(wú)雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。 菌種穩(wěn)定性的檢查 無(wú)（雜菌）檢查,五、生產(chǎn)發(fā)酵罐的無(wú)菌接種技術(shù),生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個(gè)方面： 從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入一個(gè)種子罐； 從一個(gè)種子罐移入另一個(gè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中。,壓差法 接種瓶 壓力差 火焰封口法 在種子罐接種口周?chē)O(shè)有溝槽，溝槽內(nèi)注入少量酒精，點(diǎn)燃酒精使接種口被圍在一圈火焰之中；在火焰圈中即可將菌懸液倒入種子罐中。,從種子罐到發(fā)酵罐的接種，是通過(guò)接種

24、管道，在壓力作用下進(jìn)行的。,從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器接種,從種子罐接種,第二節(jié) 實(shí)例,一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 斜面菌種一級(jí)種子培養(yǎng)二級(jí)種子培養(yǎng)發(fā)酵罐 1、斜面菌種的培養(yǎng) 菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長(zhǎng)而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對(duì)純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮而不含或少含糖為原則。 (1) 斜面培養(yǎng)基組成 葡萄糖 0.1 蛋白陳 1.0 牛肉膏 1.0 氯化鈉 0.5 瓊脂 2.02.5 PH 7.0 7.2 （傳代和保藏斜面不加葡萄糖） (2) 培養(yǎng)條件：3334，培養(yǎng)1824h。,2、 一級(jí)種子培養(yǎng) 一級(jí)種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強(qiáng)的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分，多含有機(jī)氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長(zhǎng)菌考慮。 (1) 培養(yǎng)基組成 葡萄糖 2.5 尿素 0.5 硫酸鎂 0.04 磷酸氫二鉀 0.1 玉米漿 2.53.5(按質(zhì)增減) 硫酸亞鐵、硫酸錳 各2ppm PH 70,(2) 培養(yǎng)條件 用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基200mI，滅菌后置于沖程7.6cm、頻率96次min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度3334 (3) 一級(jí)種子質(zhì)量要求 種齡：12h pH值：6.4 0.1 光密度：凈增OD值0.5以上 殘?zhí)牵?.5以下 無(wú)菌檢查：(-) 噬菌體檢查：