1、2003.8,遺傳學,第九章,基因工程與基因組學,2003.8,遺傳學,第一節(jié) 基因工程,概念：利用DNA重組技術，把一個細胞中的基因轉(zhuǎn)移到另一個細胞中，并使該基因控制的性狀能夠正確表達，這項技術稱基因工程（gene engineering).,2003.8,遺傳學,細菌的接合：,2003.8,遺傳學,1.原理： 噬菌體轉(zhuǎn)導,U形（戴維斯）管實驗： 1950年，Davis,B設計， A: trp- his+ B: trp+ his- 混合培養(yǎng)后，10-7細胞 得到100個trp+ his+ 。 沒有接合，怎么而來？,2003.8,遺傳學,研究結(jié)果：,是一種溫和型噬菌體（P22）攜帶的結(jié)果。 噬

2、菌體：稱可過濾因子。 概念：以噬菌體為媒介，把一個細菌的基因?qū)肓硪患毦@一過程稱轉(zhuǎn)導（transduction).,2003.8,遺傳學,烈性噬菌體：T2, T4,2003.8,遺傳學,溫和型噬菌體： , P1, P22,2003.8,遺傳學,亮氨酸轉(zhuǎn)導,2003.8,遺傳學,這就是天然基因工程（基因轉(zhuǎn)移）過程!,2003.8,遺傳學,2. 幾個概念：,供體（donor)：品系甲，提供基因； 受體（recepter)：品系乙，接受基因； 目的基因（target gene)：被轉(zhuǎn)移的基因，亮氨酸； 載體(vecter)：噬菌體，攜帶基因； DNA重組（recombination)：噬菌體插入

3、大腸桿菌的過程，目的基因與載體結(jié)合；,2003.8,遺傳學,幾個概念2,限制性內(nèi)切核酸酶（restriction endonucleases)和連接酶：DNA切開與連接； 感染（infection)： 載體進入受體的一種方式； 轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導等。 基因繁殖且表達。,2003.8,遺傳學,3. 基因工程的主要步驟：,. 目的基因獲得： 物理分離法； 化學合成法； 酶切（鳥槍射擊）法； 逆轉(zhuǎn)錄法； 噬菌體攝取法； 基因組克隆法等,2003.8,遺傳學,. 載體與DNA重組,合適載體；質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子等 限制性內(nèi)切酶； 連接酶；,2003.8,遺傳學,重組1,2003.8,遺傳學,重組2,2003.

4、8,遺傳學,內(nèi)切酶,2003.8,遺傳學, 把重組DNA分子送入受體：,轉(zhuǎn)化： 轉(zhuǎn)導； 基因槍 注射； 其它一切介導方法。,2003.8,遺傳學,轉(zhuǎn)化,2003.8,遺傳學,注射,2003.8,遺傳學,電激,2003.8,遺傳學,基因槍,2003.8,遺傳學,脂質(zhì)體示意圖,2003.8,遺傳學,脂質(zhì)體,2003.8,遺傳學,4. 基因工程的成就：,1.三大支柱：干擾素、人的腦激素、胰島素 2. 人的抗凝血因子轉(zhuǎn)到羊身上； 3. 抗蟲：Bt基因、胰蛋白酶基因、 4. 抗?。嚎共《净?2003.8,遺傳學,5. 基因工程要做些什么？,1. 固N； 2. 大豆蛋白基因轉(zhuǎn)到水稻中； 3. 動物蛋白基

5、因轉(zhuǎn)到植物中； 4. 疫苗抗原轉(zhuǎn)到植物中； 5. 新的抗病蟲基因轉(zhuǎn)到新品種上； 6. 大象的生長基因轉(zhuǎn)到豬身上； 7. 觀賞新類型；等等,2003.8,遺傳學,第二節(jié) 基因組學,概念：研究生物體全基因組的分子結(jié)構(gòu)和遺傳功能的學科稱基因組學（genomics)。 結(jié)構(gòu)基因組學（structural genomics)：以分析測定基因組核苷酸序列為主要目的的基因組研究； 功能基因組學（functional genomics)：研究全基因組的基因及其功能，又叫后基因組學（post-genomics)。,2003.8,遺傳學,基因組計劃（genome project)：,研究一個基因組的全部工作的規(guī)劃

6、： 1.測定全部DNA序列； 2.構(gòu)建基因組的物理圖譜； 3.構(gòu)建基因組的遺傳圖譜； 4.構(gòu)建基因組的轉(zhuǎn)錄圖譜； 5.分析基因組的功能。,2003.8,遺傳學,目前實施的基因組計劃：,微生物：大腸桿菌、噬菌體、酵母 植物：擬南芥、水稻； 動物：果蠅、豬、牛、雞等； 人。,2003.8,遺傳學,例：人類基因組計劃（HGP, human genome project）,1986.3.7 美國一個叫dulbecco在Science 上發(fā)表一篇文章：“腫瘤研究的一個轉(zhuǎn)折點：人類基因組的全序列分析”。人有310 9 bp，工作是浩瀚的。 1990年，美國國立衛(wèi)生院對“人類基因組計劃”立項，撥款30億美元

7、。 2000年，完成人的基因組草圖，完成結(jié)構(gòu)基因組學。 2005年，完成功能基因組學。,2003.8,遺傳學,HGP的目標,1. Generate sets of full-length cDNA clones and sequences that represent human genes and model organisms. （分析出代表人類全部基因和模式生物的全長cDNA克隆和序列）。 2. Support research on methods for studying functions of nonprotein-coding sequences（產(chǎn)生一種方法用來研究非蛋白編碼

8、序列的功能）。 3. Develop technology for comprehensive analysis of gene expression（研究一些技術用來理解和分析基因的表達）。,2003.8,遺傳學,4. Improve methods for genome-wide mutagenesis（研究一些技術用來研究整個基因組的突變產(chǎn)生）。 5. Develop technology for large-scale protein analyses. 研究蛋白質(zhì)大規(guī)模分析技術。,2003.8,遺傳學,顯微鏡下人的染色體,2003.8,遺傳學,人的染色體組,2003.8,遺傳學,HG

9、P與中國,1998年8月11日，中科院遺傳所“人類基因組中心”成立。 1999年2月，中心決定進行大規(guī)?；蚪M測序，以創(chuàng)造加入“國際測序俱樂部”的條件。同年7月7日，中國在國際人類基因組測序協(xié)作組登記，申請加入“國際測序俱樂部”。 并承擔了1%的染色體測序任務。,2003.8,遺傳學,中國的基因組工作室,2003.8,遺傳學,我國的工作人員正在測序,2003.8,遺傳學,HGP實驗室（圖）,2003.8,遺傳學,中國基因組人員在工作,2003.8,遺傳學,一、建立DNA（cDNA)文庫,創(chuàng)造人的46個染色體的DNA文庫，該DNA是工作的材料。測序可能要做若干次重復，因此，要有一定數(shù)量的DNA做

10、原料，即，可克隆的DNA片段（clonable Fragmant）。 DNA文庫有cDNA（complementary DNA）文庫和gDNA(genome DNA)文庫兩種。,2003.8,遺傳學,1. 取材,選取的原始個體不同，DNA文庫的基因序列，DNA序列肯定不同。白種人、黃種人、黑種人、不同地區(qū)的人，選什么人，研究者有他們的想法，可能是科學家，也可能是他們自己，更可能是隨機取樣；,2003.8,遺傳學,2.文庫的建立,DNA文庫技術 RH（Radiation Hybrid） YAC(yeast Artificial chromosome) BAC(Bacterial Artifici

11、al chromosome) PAC,cosmid,fosmid等.,2003.8,遺傳學,RH （Radiation Hybrid）方法,將人的細胞（染色體）用X-光照射打斷染色體，該細胞與鼠細胞融合，使DNA片段能插入到鼠的染色體上，擴增的細胞株中的人DNA片段(5-10Mb),得到克?。ㄒ灿蠸TS出現(xiàn)），用作分析。,2003.8,遺傳學,YAC（Yeast Artificial chromosome）方法,利用酵母染色體結(jié)構(gòu)和復制系統(tǒng)（著絲點、端粒、復制子）來復制人的DNA分子；可克隆2002000kb的DNA； 特點：克隆片段大，可達Mb級別，用作自動分析材料。,2003.8,遺傳學,

12、pYAC,2003.8,遺傳學,BAC（Bacterial Artificial Chromosome ）：,把人的染色體片段嵌入細菌的質(zhì)粒（F質(zhì)粒）中，可運載擴增100300kb DNA。 特點：較小，便于普通測序。但自動測序時顯得小。,2003.8,遺傳學,PAC文庫,PAC(P1-derived Artificial chromosome）是P1噬菌體為載體的DNA文庫?？梢钥闯?，PAC肯定較小，攜帶90-150kb 的DNA。Loannou將PAC用于人基因組，構(gòu)建了12萬個插入片段，長度為110-120kb，容量是人基因組的3倍。 1200001101000=1.321010/（31

13、09）=4.4倍，保守即約為3倍。,2003.8,遺傳學,TAC 文庫,TAC(Transformation-competent Artificial chromosome)叫可轉(zhuǎn)化人工染色體。 載體是pYLTAC7(p1質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒），可用于植物。,2003.8,遺傳學,HAC文庫,HAC(Human Artificial chromosome)叫人類人工染色體。,2003.8,遺傳學,二、DNA序列測定原理,將DNA片段用熒光等分析儀，測出DNA序列堿基排列順序。 DNA 序列測定方法： 1.化學降解法：G反應；G+T反應；T+C反應和C反應； 2.Sanger的雙脫氧法：A/T/G/C

14、四個反應。 3.自動測序法,2003.8,遺傳學,1. Sanger 的測序方法,CGCTCAGC TGGTGATT GTGT,2003.8,遺傳學,Sanger,2003.8,遺傳學,2.連續(xù)測序法,一輪 隨機引物 二輪 測出的序列 作為二輪的引物 三輪 測出的序列 作為三輪的引物,2003.8,遺傳學,三、測序-及連接方法的遴選,對文庫中的各片段逐一測序，測序后的連接則是一個巨大的任務（生物信息學）。目前有兩種思路： 1. 第一種是全基因組散彈法（whole genome shut-gun)：即從文庫中隨機取，然后分析，分析后再根據(jù)堿基序列進行拼接，由Celera提出。 步驟：取全基因組D

15、NA 純化酶切或超聲波打斷 電泳 回收DNA片段 構(gòu)建質(zhì)粒文庫 轉(zhuǎn)化宿主菌 擴增培養(yǎng) 提質(zhì)粒DNA為模板進行PCR測序 上測序儀處理測序數(shù)據(jù)補缺 完整基因組序列。,2003.8,遺傳學,. shutgun法,2003.8,遺傳學,2. 層次散彈（hierarchical shutgun）,第二種是層次散彈（hierarchical shutgun）。即把大的基因組先進行分層，如染色體編號、染色體下片段編號、小片段上作物理標記，然后再對小片段測序，這樣使最后“拼接”變得容易得多。,2003.8,遺傳學,測序的兩種思路,2003.8,遺傳學,四、建立物理圖譜和遺傳圖譜, 染色體編號 先將各個染色體

16、分離，編號：1#，1#，2#，2# 以染色體為單位甚至更小的單位用shut-gun方法再進行測序。,2003.8,遺傳學,路標技術,在不能切割成小片段進而編號時，一條染色體上要設計幾個標志，相當于編號，稱路標技術（Landmark），這個路標是有順序的，路標愈多，之間的距離愈近，路標圖譜愈精密。，目前的路標有： i STS 標志 ii EST 標志 iii SNP標志 iv RFLP 、 FLAP標志（酶切點標志） V SSR標記,2003.8,遺傳學,：STS,STS路標：STS（Sequence Tagged Site）是物理路標，如用激光切的染色體上DNA段。 當人的染色體片段在鼠的細胞

17、中，其標記是STS。STS可以較粗（長），也可以更細（短）。,2003.8,遺傳學,ii：EST路標,EST標簽：EST（expressed sequence tag）叫表達序列標簽，實際上是遺傳圖譜，即已知的某一基因序列。用cDNA短片測序后，可做為EST標簽。顯帶法和其他基因定位法鑒別的可表達基因位點也是EST。,2003.8,遺傳學,iii：RFLP 標志,RFLP（Restricfion Frafment length polymophism）叫限制性片段長度多態(tài)性。由于多態(tài)性，同一種酶對同一區(qū)DNA（不同個體）進行處理，會得到不同的長段的區(qū)帶，這個酶切位點一般是一定的，因此，其片段也

18、是相同的。 不同的內(nèi)切酶處理，可得到不同限制性片段，因此有不同長度的文庫?？捎脕磉M行測序結(jié)果的比較。,2003.8,遺傳學,不同的RFLP,酶A 酶B,2003.8,遺傳學,電泳圖,2003.8,遺傳學,iv：SNP路標,SNP（single nucleotide polymorphism）叫單核苷酸多態(tài)性。指基因組中核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性。包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入/缺失等。SNP位點極其豐富，在人的基因組中，每1000bp就會有1個SNP，這樣人的基因組中有300萬個SNP。,2003.8,遺傳學,SNP,2003.8,遺傳學,五、功能基因組計劃：,1. 遺傳圖譜分析對應

19、； 2. 分子標記確定基因位置和功能； 3. 反求遺傳學（人為創(chuàng)造突變體）； 4. 其它方法。,2003.8,遺傳學,高速離心,2003.8,遺傳學,中國的HGP實驗室（圖注）,1999年9月，中國獲準加入人類基因組計劃，負責測定全部序列的1%。坐落在北京順義空港工業(yè)園B區(qū)的中科院遺傳所人類基因組中心承擔了1%主要測序任務。1999年4月至今，被實驗人員成為“元老”的中心的第一臺計算機仍在24小時運行。圖為這臺計算機上擺放著三根玉米棒，旁邊有一行字：窮棒子精神永遠光芒。,2003.8,遺傳學,中國基因組人員在工作,2003.8,遺傳學,1999年9月，中國獲準加入人類基因組計劃，負責測定全部序

20、列的1%。坐落在北京順義空港工業(yè)園B區(qū)的中科院遺傳所人類基因組中心承擔了“1%”主要測序任務。圖為2001年5月，他們從美國引進的三十臺世界上最先進的基因測序儀。這使中國的基因測序能力提高了五倍，超過了原來領先于中國的德國和法國，僅次于美國、英國和日本。,2003.8,遺傳學,1%的測序任務棄掉1200萬只槍頭,2003.8,遺傳學,2000年公布人的基因組草圖,德國教育和科技部長在公布人的基因組草圖測序結(jié)果2001.2.13,2003.8,遺傳學,國家主席江澤民2001.11.28在北京會見來華參加“人類基因組測序第十次戰(zhàn)略會議”的科學家,2003.8,遺傳學,中國科學家完成水稻圖譜,2003.8,遺傳學,第三節(jié) 基因診斷,又叫分子標記診斷。 限制性片段診斷。,2003.8,遺傳學,例：,1 2 3 4 5 一個DNA（正常），若有某一內(nèi)切酶4個切口，它將產(chǎn)生5個片段；若1最短，5最長，電泳后：,2003.8,遺傳學,限制圖譜