1、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù),化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù),慨 述 - 化學(xué)發(fā)光 - 化學(xué)發(fā)光效率 化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù) - 化學(xué)發(fā)光劑 - 發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 - 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析 - 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 - 電化學(xué)發(fā)光免疫分析,什么是發(fā)光免疫分析？ 是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測(cè)微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。,放射免疫技術(shù),酶免疫技術(shù),發(fā)光免疫技術(shù),三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù),發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài) （較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），然后再 返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。 根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為: 光照發(fā)光、生物發(fā)光、

2、化學(xué)發(fā)光等。,發(fā)光的基礎(chǔ)知識(shí),光照發(fā)光（photoluminescence）指發(fā)光劑（熒光素） 經(jīng)短波長(zhǎng)的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā) 態(tài)，其回至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光。 生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內(nèi)的 發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光 素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧 化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形 式釋放出來。 化學(xué)發(fā)光,發(fā)光的基本類型,化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物

3、分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。 化學(xué)發(fā)光又分為： 直接化學(xué)發(fā)光 間接化學(xué)發(fā)光,什么是化學(xué)發(fā)光,一些化學(xué)反應(yīng)能釋放足夠 的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激 發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)， 若被激發(fā)的是一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物 分子，則這種反應(yīng)過程叫直 接化學(xué)發(fā)光。 反應(yīng)過程簡(jiǎn)單地描述如下： A十B C* C* C h 為光子，C*表示C處于激發(fā)態(tài),直接化學(xué)發(fā)光,若激發(fā)能傳遞到另一個(gè)未參加化學(xué)反應(yīng)的分子D上， 使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基 態(tài)時(shí)發(fā)光，這種過程叫間接化學(xué)發(fā)光。 反應(yīng)過程表示如下： A十B C* C*十

4、D C十D* D* D十h,間接化學(xué)發(fā)光,化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù),在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。,一、化學(xué)發(fā)光劑,發(fā)光的量子產(chǎn)率高； 它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測(cè)定的 物質(zhì)相匹配； 能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物； 其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果； 在所使用的濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒有毒性,化學(xué)發(fā)光劑的基本條件,直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化 作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生 發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。,（一）直接化學(xué)發(fā)光劑,一. 代表物質(zhì)：吖啶酯，在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長(zhǎng)4

5、70nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。,二. 另一類代表物質(zhì)： 三聯(lián)吡啶釕，RU(bpy)32+是電化學(xué)發(fā)光劑， 它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時(shí)失去 一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。,三聯(lián)吡啶釕,電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理,利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑 （底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑。 代表物質(zhì)： 魯米諾及其衍生物，AMPPD,（二）酶促化學(xué)發(fā)光劑,魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理,AMPPD 3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷,化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型,用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本

6、中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。,一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析,發(fā)光,Y,Y,Y,磁微粒子,被測(cè)抗原,+,抗體,+,丫啶酯標(biāo)記物抗體,沖洗后,（1） 加入H2O2 （pH10）,（2） 加入堿 （pH10）,直接化學(xué)發(fā)光分析-夾心法,電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassa

7、y，ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶 釕標(biāo)記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體， 在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光 反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程。,二、電化學(xué)發(fā)光免疫分析,磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，在反 應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗原 (抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗 體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí) 引人TPA緩沖液。 當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合 的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使 三聯(lián)吡啶釕和TPA在電

8、極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光強(qiáng)度與待測(cè)抗 原濃度成正比。,電化學(xué)發(fā)光免疫分析,電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖,以TSH為例： 第一步： 結(jié)合了活化的三聯(lián)吡啶釕衍生物即Ru(bpy)32+ + N羥基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗體和結(jié)合 了生物素的TSH抗體與待測(cè)血清同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)杯中，孵育9分鐘。 第二步： 將被鏈霉親和素包被的磁珠加入反應(yīng)杯中，再次孵育9分鐘，使生物素通過與親和素的結(jié)合將磁珠、 TSH抗體連接為一體，形成雙抗體夾心法。 下一步，蠕動(dòng)泵將形成的Ru(bpy)32+抗體抗原抗體磁珠復(fù)合體吸入流動(dòng)測(cè)量室，此 時(shí)，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時(shí)，游離的TSH抗體

9、（與生物素結(jié)合的和與Ru (bpy)32+結(jié)合的抗體）也被吸出測(cè)量室。緊接著，蠕動(dòng)泵加入含三丙胺（TPA）的緩沖液，同時(shí)電 極加電壓，啟動(dòng)ECL反應(yīng)過程。發(fā)光劑Ru(bpy)32+和電子供體TPA在陽極表面可同時(shí)各失去一個(gè) 電子而發(fā)生氧化反應(yīng)，使二價(jià)的Ru(bpy)32+被氧化成三價(jià)，后者是一種強(qiáng)氧化劑；另一方面， TPA 被氧化成陽離子自由基TPA+q，后者很不穩(wěn)定，可自發(fā)失去一個(gè)質(zhì)子（H+），形成自由基 TPAq，這是一種很強(qiáng)的還原劑，可將一個(gè)電子給三價(jià)的Ru(bpy)33+，使其形成激發(fā)態(tài)的Ru (bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+通過熒光機(jī)制

10、衰減，發(fā)射 出一個(gè)波長(zhǎng)620nm的光子，重新生成基態(tài)的Ru(bpy)32+。該過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行， 產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測(cè)光強(qiáng)度，光強(qiáng)度與Ru(bpy)32+的濃度呈線性關(guān)系，故可測(cè)出待測(cè) 抗原的含量。 最后，終止電壓，移開磁珠，加入清洗液沖洗流動(dòng)測(cè)量室，準(zhǔn)備下一個(gè)樣品測(cè)定。,化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后

11、，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，處理信號(hào)計(jì)算出測(cè)定物的濃度。,三、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析,該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體(或抗原)， 在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固 相包被抗體-待測(cè)抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米 諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。,（一）HRP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析,HRP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析,該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系 中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待 測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶 使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。,（二）AKP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析,AKP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析,加樣品、磁顆 粒子、試劑,孵育，使反 應(yīng)物結(jié)合,清洗去除未 結(jié)合物質(zhì),加入底物 產(chǎn)生信號(hào),孵育，促使信 號(hào)的產(chǎn)生