1、厭 氧 氨 氧 化Anammox,主要內容,Anammox 研究進展,水體富營養(yǎng)化,水體富營養(yǎng)化,2011中國環(huán)境狀況公報,在監(jiān)測的26個湖泊（水庫）中，富營養(yǎng)化狀態(tài)的湖泊（水庫）占53.8%，其中，輕度富營養(yǎng)狀態(tài)和中度富營養(yǎng)狀態(tài)的湖泊（水庫）比例分別為46.1%和7.7%。,水體富營養(yǎng)化,水體富營養(yǎng)化,水體氮素污染,傳統(tǒng)生物脫氮工藝,滿足,厭氧氨氧化工藝,低碳氮比、高氨氮有機廢水。,Anammox 定義,Anammox：在缺氧條件下通過微生物的作用，以亞硝酸氮為電子受體，氨氮為電子供體，將亞硝酸氮和氨氮同時轉化為N2的過程。,Anammox 發(fā)展簡史,1977年， Broda根據(jù)自由能的變化

2、，預言自然界中存在著能催化亞硝酸和硝酸氧化氨的細菌，認為它們是隱藏于自然界的自養(yǎng)型細菌。 1995年，Mulder和van de Graaf等用流化床反應器研究生物反硝化時，發(fā)現(xiàn)了氨氮的厭氧生物氧化現(xiàn)象，從而證實了Broda的預言。 2002年，世界第一座Anammox工業(yè)化生產反應器在荷蘭鹿特丹污水處理廠投入運行。,Baltimore 內港、日本海 Chesapeake 海灣 波羅地海的芬蘭灣 安哥拉的Benguela上升流 英國的泰晤士河口 丹麥Mellerup 河口 南海等,2002,2003,2004,2004-2013,海洋中,1 厭氧盆地黑海 2 哥斯達黎加 Golfo Dulce

3、 海灣,北極圈 極地海冰,波羅的海 過渡區(qū) 大陸架沉積物,Anammox 分布,Anammox 分布,除了海洋、河口、海灣外，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中也存在Anammox，濕地、農田土壤、凍土層、蓄水層等土壤干濕界面也有探測到Anammox菌。,Anammox 生物脫氮研究,荷蘭Delft大學生物技術系：Anammox 研究的發(fā)源地；目前主要研究Anammox脫氮工藝及其應用。 荷蘭的Paques 公司首家將Anammox 工藝工程化應用的公司。 世界10座Anammox 廢水處理工程： 荷蘭的Rotterdam，Lichtenvoorde，Olburgen；德國的Hattingen， Mechern

4、ich；日本的Mie Prefecture；澳大利來的 Strass；瑞士的Glanerland 和Kollikon 以及英國的Pitsea 。,Anammox 生物脫氮研究,澳大利亞昆士蘭大學的JS Fuerst團隊 ：研究細胞生物學，與奈梅亨大學團隊一起探明了厭氨氧化體的結構及其生理特性。 法國的國家基因測序公司Genoscope與Nijmegen團隊、Vienna團隊以及Munich團隊 ：2005年完成了厭氧氨氧化菌Kuenenia Stuttgartiensis全基因組的測序。 荷蘭海洋研究中心的Jaap Damste研究團隊 ：海洋生態(tài)系統(tǒng)有關厭氧氨氧化的研究，并探明了厭氧氨氧化菌

5、特征性的階梯烷細胞化學組分 。 MPE Bremen研究團隊 ：首次證實海洋中存在厭氧氨氧化活性 。,Anammox 生物脫氮研究,浙大鄭平教授團隊：研究Anammox 菌種、工藝和設備。 2008年， 成功將Anammox 應用于味精廢水處理，建立了國內第一個Anammox 處理實際廢水工程； 中國科大俞漢青教授團隊： 研究Anammox 污泥顆?；?，成功培育Anammox 顆粒污泥。 大連理工楊鳳林教授團隊：分子生物學手段檢測Anammox 的菌群組成。 北京建筑工程學院郝曉地教授團隊：側重工藝及實際應用研究。 華南理工大學周少奇教授、胡勇為教授團隊： Anammox 處理垃圾滲濾液。 廣

6、州微生物所沈萍教授團隊： Anammox 處理垃圾滲濾液。,分子生物學：在生物化學與遺傳學、微生物學、細胞學、生物物理學等學科相結合的基礎上發(fā)展起來的嶄新學科。 研究對象：生物大分子核酸（DNA 和RNA）。,分子生物學技術,熒光原位雜交技術 FISH,多聚酶鏈式反應 PCR,變性梯度凝膠電泳DGGE,DNA克隆,DNA測序及序列分析,分子生物學技術,熒光原位雜交技術：fluorescent in situ hybridazation，F(xiàn)ISH 20世紀70年代后期 根據(jù)已知微生物不同分類級別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標記的特異寡核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，檢測該

7、特異微生物種群的存在與豐度。 特點： 可進行樣品的原位雜交，避免細菌的純培養(yǎng)過程 可有效反應環(huán)境樣品中細菌數(shù)量及空間位置，并具有定性、定量分析和空間位置識別特點 環(huán)境中特定微生物種群的鑒定、種群數(shù)量分析及其特異微生物跟蹤檢測，采用該技術已發(fā)現(xiàn)了許多新的微生物物種。,熒光原位雜交技術 FISH,多聚酶鏈式反應：polymerase chain reaction，PCR 美國Cetus公司Mullis等 1985年 一套大量快速擴增特異DNA片段的系統(tǒng)，屬DNA體外合成技術 類似于生物體內DNA的復制過程，重復經過若干個變性、退火、延伸這3 步循環(huán)，就可以使目的DNA 擴增放大。 通過PCR，可以

8、在幾小時內將一個分子的遺傳物質成百乃至上億倍的復制。該技術具有特異性強、靈敏度高、快速、簡便以及重復性好等特點和優(yōu)點。 經典PCR 熒光定量PCR(Real-time PCR),多聚酶鏈式反應 PCR,環(huán)境樣品DNA含量過低,變性梯度凝膠電泳 denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE：Myers等創(chuàng)建，屬于DNA指紋圖譜技術。 PCR擴增產物在具有變性濃度梯度的聚丙烯酰胺凝膠中具有不同的遷移位點，不同的GC含量在膠中產生不同分離的條帶，每一條條帶代表一個不同的微生物種群，通常用條帶數(shù)目的多少來反映微生物種群的多樣性，用條帶的染色強度反映不同細菌種群

9、的豐度。 DGGE在微生物分子生態(tài)學方面的應用： 對復雜微生態(tài)系統(tǒng)的解析成為可能 對微生物群落動態(tài)變化的研究成為可能,變性梯度凝膠電泳 DGGE,環(huán)境樣品微生物分析存在的問題： 得不到足夠的目標物質進行分析 微生物體內的蛋白質，能被純化的部分幾乎不到一半，真核細菌的蛋白質則更難得到 分子克隆：將目標DNA片斷插入一段自復制的DNA 分子（克隆載體）中，而后目標DNA片斷就和載體復制在一起，將這個攜帶著目標DNA片斷的載體在宿主細胞（如酵母菌）中克隆后就可產生大量的被插入的目標DNA片斷。,DNA 克隆,DNA測序：采用高溫使DNA雙鏈變性，引物被退火后得到延伸。 Taq DNA 多聚酶也是DN

10、A 測序反應中常用的酶，它能使染料標記的DNA終端分布更加均勻，具有較高的測序準確度。 DNA 序列分析：測序后一個重要步驟。 不同微生物有不同DNA序列，因此經過準確和合理的序列分析即能鑒定目標微生物。 通過網絡數(shù)據(jù)資源得到有關的序列信息 應用軟件在數(shù)據(jù)庫中查詢 通過系統(tǒng)發(fā)育分析確定微生物在發(fā)育過程中種屬關系。,DNA 測序及序列分析,細菌總DNA提取、特異性PCR擴增16S rDNA、16S rDNA克隆、16S rDNA基因測序和16S rDNA基因序列分析。,Anammox 菌的分子生物學鑒定,迄今為止共發(fā)現(xiàn)了9 個種的厭氧氨氧化菌，分別歸在5 個屬中，并建立了厭氧氨氧化菌科（Anam

11、moxaceae） “Candidatus Brocadia anammoxidans” “Candidatus Brocadia fulgida” “Candidatus Kuenenia stuttgartiensis” “Candidatus Scalindua brodae” “Candidatus Scalinduawagneri” “Candidatus Anammoxoglobus propionicus” “Candidatus Jettenia asiatica” “Candidatus Anammoxoglobus sulfate ” “Candidatus Scalind

12、ua sorokinii”,Anammox 菌的分子生物學鑒定,Strous等最先發(fā)現(xiàn)Candidatus Brocadia anammoxidans并確定其16S rDNA 序列及在細菌進化樹上的位置，B.anammoxidans的16S rDNA基因序列常被用來設計為特定的寡核苷酸探針，以用于熒光原位雜交(FISH)。 Schmid等在德國幾個污水處理廠中發(fā)現(xiàn)Candidatus Kuenenia stuttgartiensis ，它們的16S rDNA 序列形成了一個明顯獨立的種群，其中有85%的細菌與已發(fā)現(xiàn)的B.anammoxidans的16S rDNA序列相似性少于90%，因而認為是

13、一種新的厭氧氨氧化菌。,Anammox 菌的分子生物學鑒定,革蘭陰性菌 專性厭氧菌 紅菌 470nm有較強的吸收峰,多樣，呈球形、卵形等 直徑0.8-1.1m 無莢膜 壁表面有火山口狀結構 有少量菌毛,細胞壁 細胞膜 細胞內 厭氧氨氧化體 核糖細胞質 外室細胞質,生理 特征,個體 形態(tài),細胞 結構,Anammox 反應機理,Anammox菌生理生化特征,Anammox 菌,圖2 顆粒污泥外觀掃描電鏡照片,圖1 Anammox顆粒污泥,圖3 反應器內富集培養(yǎng)物,Anammox 菌,圖4 顆粒污泥內部 Anammox 菌,圖5 顆粒污泥超薄切片，透射電鏡照片,羥胺和聯(lián)氨氧化還原酶（HAO） 厭氧氨

14、氧化分解代謝的場所。,1、特有結構 2、占細胞體積30%以上 3、可完整分離 4、單層不可滲透的膜包圍 5、幾乎無RNA/DNA,厭氧氨氧化體,Anammox 反應機理,Anammox 反應機理,1997年，Van de Graaf 等通過15N 標記實驗發(fā)現(xiàn)： 羥胺（ NH2OH）最可能是氨氧化的電子受體，并推測出其代謝途徑。 厭氧氨氧化菌首先NO2- 轉化成NH2OH ，再以NH2OH 為電子受體將NH4+ 氧化形聯(lián)氨（N2H4） ；N2H4 轉化成N2 ，并為NO2- 還原成NH2OH 提供電子。 試驗中有少量NO2- 被氧化成NO3- , 推測可能是為厭氧氨氧化菌固定CO2 提供電子。

15、 生物轉化過程中存在以下平衡關系: NH4+ : NO2- : NO3- = 1: 1.32: 0.26。,Fig. 6 Possible metabolic pathway for Anammox,Anammox 反應機理,Anammox 影響因素,影響 因素,pH,泥齡,氧,基質濃度,磷酸鹽,有機物,溫度,光,溫度：適宜溫度為30-40。 pH： 影響細菌（電解質平衡和酶活性）和基質（ FA和游離亞硝酸）。 氧：有抑制作用，微氧條件(0.5%空氣飽和度) 可完全抑制，但該抑制作用是可逆的；大于18%空氣飽和度，菌群不可恢復。,最適pH為 6.7-8.3,Anammox 影響因素,基質濃度：

16、氨濃度和硝酸鹽濃度低于1000 mg/L不產生抑制；亞硝酸鹽濃度超過100 mg/L產生明顯抑制。 泥齡：厭氧氨氧化菌生長緩慢，故泥齡越長越好。 有機物：異養(yǎng)菌增殖較快，從而抑制厭氧氨氧化活性。,Anammox 影響因素,磷酸鹽：高濃度的磷酸鹽有抑制作用。 對Brocadia anammoxidans，加入1mM的磷酸鹽對其活性無影響，但加入5mM完全抑制； 而Kuenenia stuttgartiensis耐受力為20mM。 光：厭氧氨氧化菌屬光敏性微生物，光能抑制其活性，降低30%-50%的氨去除率。,Anammox 影響因素,Anammox 特點,同比例除氮,1,2,3,4,無機碳源 C

17、O2,自養(yǎng)菌 紅色 生長慢,厭氧 對氧敏感,優(yōu) 點,已知的最簡捷、最經濟的生物脫氮途徑,與傳統(tǒng)硝化/反硝化相比,無需 外加碳源,污泥 產量少,無需供氧,無需 外加堿度,倍增時間長，生長緩慢 抗沖擊負荷能力弱 對環(huán)境條件要求苛刻，DO、溫度、pH、有機物等會對Anammox過程產生影響,缺 點,不同脫氮工藝比較,兩相Sharon-Anammox工藝,單相CANON工藝,Anammox 應用現(xiàn)狀,兩相Sharon-Anammox工藝,Sharon：single reactor for high activity ammonia removal over nitrite Sharon-Anammox

18、工藝是一種將短程硝化和厭氧氨氧化聯(lián)合的脫氮工藝。 荷蘭Delft大學2001年開發(fā)的。,兩相Sharon-Anammox工藝,在兩個反應器內，先在一個反應器內有氧條件下，利用氨氧化細菌將NH4+氧化生成NO2-；然后在另一個反應器缺氧條件下，以NH4+為電子供體，將NO2-反硝化。,1 基本原理,NH4+ HCO3-+ 0.75O2 0.5NH4+ 0.5NO2-+ CO2+ 1.5H2O NH4+ 1.32NO2-+ 0.066HCO3+ 0.13H+ 1.02N2+ 0.26NO3-+ 0.066CH2O0.sN0.1s+ 2.03H2O,兩相Sharon-Anammox工藝,分別在兩個反應器內實現(xiàn)部分硝化和厭氧氨氧化，能優(yōu)化兩類細菌的生存環(huán)境，運行性能穩(wěn)定。 與傳統(tǒng)硝化反硝化過程相比： 運行費用減少90% CO2排放量減少88%，不產生N2O有害氣體 無需有機物 不產生剩余污泥 節(jié)省占地面積,2 優(yōu)點,荷蘭鹿特丹污水處理廠,2002年 世界上第一個生產性Sharon-Anammox工藝在荷蘭鹿特丹污水處理廠正式運行，用于處理處理污泥消化液。 設計處理流量為550m3/d SHARON 反應器有效容積1650