1、第二章,發(fā)酵工業(yè)菌種,本章內(nèi)容,1 菌種篩選,2 菌種改良,一、常用的工業(yè)微生物 二、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選,1 菌種篩選,一、常用的工業(yè)微生物 p13,1、細菌 醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌 乳酸桿菌 枯草桿菌,乳酸桿菌,醋化醋桿菌,枯草桿菌,1、細菌 丙酮丁醇梭菌 大腸桿菌 谷氨酸棒狀桿菌,丙酮丁醇梭菌,谷氨酸棒狀桿菌,2、酵母菌 釀酒酵母 假絲酵母屬 產(chǎn)朊假絲酵母 解脂假絲酵母 熱帶假絲酵母 畢赤酵母屬、漢遜酵母屬,一、常用的工業(yè)微生物,釀酒酵母,熱帶假絲酵母,熱帶假絲酵母,產(chǎn)朊假絲酵母,3、霉菌 曲霉屬 米曲霉 黑曲霉 青霉屬 青霉菌：點青霉、產(chǎn)黃青霉 桔青霉,一、常用的工業(yè)微生物

2、,青霉屬,產(chǎn)黃青霉,曲霉屬,米曲霉,黑曲霉,3、霉菌 根霉屬: 德氏根霉 米根霉、小麥曲根霉 紅曲霉屬 紫紅曲霉,根霉屬,米根霉,4、放線菌 鏈霉菌屬 小單孢菌屬 地中海諾卡氏菌,一、常用的工業(yè)微生物,5、未培養(yǎng)微生物p14,定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物。 其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99。,一、常用的工業(yè)微生物,二、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選P15,菌株分離：將混雜著各種微生物的樣品按照實際需要和菌株的特性采取迅速、準確、有效的方法對它們進行分離、篩選，進而得到所需微生物的過程。,（一）、 菌種選擇的要求p15,培養(yǎng)基原料來源廣、產(chǎn)物易回收

3、 發(fā)酵周期較短； 條件易控制； 抗病毒（噬菌體）、雜菌能力強； 菌種不易變異退化； 對放大設備的適應性強； 菌種不是病原菌,（二）、菌種分離的一般過程 P15,標本采集, 預處理, 富集培養(yǎng), 菌種分離（初篩、復篩）, 發(fā)酵性能鑒定,如何使樣品中所含微生物的可能性大？,如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)？,目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物,問題：, 菌種保藏,1、樣品的采集p15,樣品來源越廣泛，獲得新菌種的可能性越大。 采樣時應注意的問題: A、土壤的有機質(zhì)含量和通風狀況 B、土壤的酸堿度和植被狀況 C 、地理條件 D 、季節(jié)條件,A、土壤的有機質(zhì)含量和通風狀況 P16,耕地、菜園、

4、近郊土壤：土質(zhì)通氣保水性能好，微生物生長旺盛，數(shù)量多，尤其細菌和放線菌較多,山坡上的森林土壤：有機質(zhì)豐富，微生物生陰暗潮濕，適合霉菌和酵母菌生長,沙土、貧瘠的土地：細菌數(shù)量少,果園：樹根土壤中酵母菌含量較高（偏酸）,豆科植物根系土壤：根瘤菌較多,B、土壤的酸堿度和植被狀況,腐殖土：霉菌較多,油田土壤：分解石油的微生物較多,自然環(huán)境中的天然菌群，可因人類的生產(chǎn)或生活而改變。 如在土壤中加去莠津（2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5-三嗪 ），會導致放線菌群的增加；在殺真菌劑存在下，諾卡氏菌屬的菌更容易分離到。,C、地理條件,南方溫度高、溫暖季節(jié)長、雨水多、相對濕度高、植被覆蓋面廣、土壤有

5、機質(zhì)豐富：許多工業(yè)微生物菌種，如抗生素產(chǎn)生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大都從南方獲取,北方：秋季采土樣最為理想,D 、季節(jié)條件,上節(jié)知識回顧,一、常用的工業(yè)微生物 二、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選 1、樣品的采集 A、土壤的有機質(zhì)含量和通風狀況 B、土壤的酸堿度和植被狀況 C 、地理條件 D 、季節(jié)條件,采土樣的方法,南方：用取樣鏟，將表層5cm（陽光直射，蒸發(fā)量大水分少，而且受紫外線照射）左右的浮土除去，取525cm處的土樣1025g，裝入事先準備好的塑料袋內(nèi)扎好。 北方：土壤干燥，可在1030cm處取樣。給塑料袋編號并記錄地點、土壤質(zhì)地、植被名稱、時間及其他環(huán)境條件。 一般樣品取回后應馬上分離，以免微

6、生物死亡。,目的：提高菌種分離的效率。 物理方法：加熱(55,6min；100,1h；40 2-6h)、膜過濾法、離心法、空氣攪拌法 化學方法：含1%幾丁質(zhì)培養(yǎng)基、用CaCO3提高pH值進行培養(yǎng)（鏈霉菌屬） 誘餌法：用涂石蠟的棒置于碳源培養(yǎng)基中（諾卡氏菌）、花粉（游動放線菌）、蛇皮（小瓶菌屬）、人頭發(fā)（角質(zhì)菌屬）,2、樣品的預處理 p16,富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。,富集培養(yǎng)是在目的微生物含量較少時，根據(jù)微生物的生理特點，設計一種選擇性培養(yǎng)基或創(chuàng)造有利生長條件，使目的微生物數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種，以利于分離得到所需要的菌株。,3、

7、富集培養(yǎng) p17,富集的基本方法： 1、控制營養(yǎng)：如以唯一碳源或氮源作底物； 2、控制培養(yǎng)條件：如pH、溫度、通氣量等； 3、抑制不需要的種類。,富集培養(yǎng)方法： 1、分批式富集培養(yǎng)（P17）：指將富集培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到新的同一種培養(yǎng)基中，重新建立選擇性壓力，如此重復幾次后，再取此富集培養(yǎng)物接種至固體培養(yǎng)基上，以獲得單菌落。轉(zhuǎn)種是關(guān)鍵。 2、連續(xù)培養(yǎng)（P17）：通過改變限制性基質(zhì)濃度，來控制兩類不同菌株的比生長速率。 3、半連續(xù)培養(yǎng)（P18）：即分批補料培養(yǎng),4、菌種分離P18,從產(chǎn)物角度出發(fā),在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設計培養(yǎng)基；,利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素。,從形態(tài)的角度,菌落的外觀形態(tài)

8、，是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。,（1）、常規(guī)分離法：,平板劃線法 稀釋分離法 涂布法,A 分區(qū)劃線法 B 連續(xù)劃線法,將樣品分散到最低濃度,倒平板，培養(yǎng)，挑取單菌落,后面3個稀釋度各取0.1 ml涂布,透明圈法 變色圈法 抑菌圈法 生長圈法,（2）、生化反應分離法：,在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁，這樣能分解該底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈。,圈的大小可初步反映該菌株利用底物的能力，完全可以作為菌種初篩的判斷標準。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶產(chǎn)生菌的分離，產(chǎn)有機酸菌的初篩。,透明圈法,例1：分離某

9、種產(chǎn)生有機酸的菌株時，在培養(yǎng)基中添加碳酸鈣。,例2：分離淀粉酶產(chǎn)生菌時，培養(yǎng)基以淀粉為唯一碳 源，待樣品涂布到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)形成單個菌落 后，再用碘液浸涂，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水 解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株。,對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。,變色圈法,例1：分離果膠酶產(chǎn)生菌，用含0.2%果膠為唯一碳源，菌落長成后加入0.2%的剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)降紅色的變色圈。 例2：分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌，除了用酪蛋白作底物平板產(chǎn)生透明圈進行鑒別外，還可用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養(yǎng)基內(nèi)，產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水

10、解吲羥乙酸酯為3-羥基吲哚，后者能氧化生成藍色產(chǎn)物，根據(jù)變色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶菌株。,若被檢菌能分泌某些抑制工具菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會在該菌落的周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，被鑒別出來。,抑菌圈法：,常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離。工具菌的選擇是關(guān)鍵，工具菌采用抗生素的敏感菌。 傳統(tǒng)上常用金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌作為工具菌檢驗抗生素的抗性，現(xiàn)采用聯(lián)合工具菌如枯草芽孢桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌或巴氏梭狀芽孢桿菌，可分離出抗菌活性低，對其它試驗菌活性高的新抗生素，如黃色霉素族的抗生素，而這些抗生素在單獨使用枯草芽孢桿菌作工具菌時無法檢出。,抑菌圈自動測量分析儀,如，嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌與

11、不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品進行保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為 。,常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素等產(chǎn)生菌。其工具菌是一些相對應的營養(yǎng)缺陷型菌株，由于得到所需的營養(yǎng)，凡是目的微生物周圍便會出現(xiàn)一個混濁生長圈。,生長圈法：,2 發(fā)酵工業(yè)菌種改良,一、誘變育種 二、航天育種,自然選育,一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。,單細胞(孢子)懸液的制備,平板分離,挑選單菌落 (注意形態(tài)的觀察),發(fā)酵試驗,自然選育是一種簡單易行的方法，可達到純化菌種、防止菌種退化、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量的目的。但其突變率很低，因而要采用新方法進行菌株的改良。,改良的具體目標p23,提高目標產(chǎn)物的

12、產(chǎn)量 提高目標產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物 改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程 改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品,改良的方法,常規(guī)育種(誘變育種) 細胞工程育種 基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù) 基因工程育種 蛋白質(zhì)工程育種 代謝工程育種,一、誘變育種,人工利用各種誘變劑誘發(fā)基因突變，再通過適當?shù)暮Y選方法獲得所需要的優(yōu)良菌種的育種方法，稱為誘變育種。,誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì),從青霉素產(chǎn)量看誘變育種,效價：指有效成分的濃度。1g/ l稱為1 單位,化學誘變劑都具毒性，其中90%以上是致癌物質(zhì)或極毒藥品，使用時要格外小心，不能宜接用口吸，避免與皮膚直接接觸，不僅要注意自身安全，也要防上污染環(huán)境，造成公害

13、。,（一）、化學誘變劑使用過程的安全性,是一種強烈致癌物質(zhì)，操作時要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風櫥中進行。凡接觸過NTG的器皿必須及時、單獨處理，例用自來水大量沖洗或用1-2N的NaOH浸泡過夜，洗凈。,NTG（N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍）,是劇毒的誘變劑，在整個誘變過程，包括配制藥品、操作處理、保存等都要嚴守安全，不能接觸皮膚，所有接觸過EMS的器皿，單獨用大量水沖洗洗滌，或用10NaS2O3溶液浸泡過夜，再用清水沖洗干凈。,EMS（甲基磺酸乙酯）,(二）誘變育種應考慮的因素P25,1、選擇合適的出發(fā)菌株,合適的出發(fā)菌株就是通過育種能有效地提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量的菌

14、株。,定義：出發(fā)菌株指用于誘變育種的最初菌株或每代誘變的試驗菌株，也稱親株。,（1）選擇出發(fā)菌株的要求, 對菌株產(chǎn)量，形態(tài)、生理等情況了解； 生長繁殖快，營養(yǎng)要求低，產(chǎn)孢子多且早； 對誘變劑敏感； 菌株要有一定的生產(chǎn)能力； 多出發(fā)菌株：一般采用34個出發(fā)菌株，在逐代處理后，將產(chǎn)量高、特性好的菌株留作繼續(xù)誘變的出發(fā)菌株。,出發(fā)菌株及生理狀態(tài)：真菌、酵母106個/ml，放線菌孢子106107個/ml,細菌108個/ml， 細菌選擇對數(shù)生長期，真菌和放線菌使用幼年孢子，芽孢細菌也可以用芽孢進行誘變處理。 力求90%以上為單孢子，制菌懸液用生理鹽水或緩沖溶液。,（2）出發(fā)菌株的選擇,2、復合誘變劑的使

15、用 誘變劑復合處理的效果往往好于單獨處理。 復合處理有幾類： 一類是兩種或多種誘變劑的先后使用； 第二類是同一種誘變劑的重復使用； 第三類是兩種或多種誘變劑的同時使用。,劑量的大小常以致死率和誘變率來確定。 最適劑量是指能夠提高正突變株變異頻率幅度的誘變劑量。 處理劑量大，致死率高，誘變率也會提高，但達到一定程度后，再提高劑量反而會下降；但誘變劑量也不宜過低，否則很難獲得所需的正突變株。 致死率90%99.9%（過去） 70%80%（現(xiàn)在）。,3、誘變劑劑量的選擇,4、變異菌株的篩選 挑選菌株一般要從菌落形態(tài)變異類型著手，發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)量相關(guān)的特征，并根據(jù)這些特征，進行篩選、鑒定。一般要經(jīng)過初篩和復

16、篩兩個階段。 如:青霉素產(chǎn)生菌高產(chǎn)突變菌種的篩選,初篩：誘變后稀釋涂布平板培養(yǎng)挑單個菌落到斜面培養(yǎng)將斜面上的菌落逐個接種到搖瓶振蕩培養(yǎng)測抗生素效價 超過對照效價10%以上的菌種，進行復篩。 復篩：過程與初篩基本相同，不同的是一般將斜面上的單個菌落接種到三個搖瓶中，得出平均效價。復篩可進行13次。 由此篩選出的高產(chǎn)穩(wěn)定菌種還要經(jīng)過小型甚至中型試驗，才能用到發(fā)酵生產(chǎn)中。,（三）、誘變劑處理的方式,（1）直接處理：將菌懸液用誘變劑直接處理，然后分離。 （2）生長過程處理：適用于誘變作用強而致死率低的誘變劑，或只在分裂過程中對DNA起作用的誘變劑，如秋水仙素。這些誘變劑一般都直接加入到培養(yǎng)基中，混勻，

17、倒入平皿制成平板后培養(yǎng)，在生長過程中誘發(fā)菌體突變。 （3）振蕩培養(yǎng)處理：即在搖瓶培養(yǎng)基中加入一定量的誘變劑。菌體隨著振蕩培養(yǎng)，不斷地和誘變劑接觸，它們之間的作用遠比平板生長過程處理充分得多，所以誘變劑濃度不宜過高。,（四）、誘變篩選流程 (致死率、突變率、正變率、高產(chǎn)率、投產(chǎn)率),出發(fā)菌種,斜面,或搖瓶培養(yǎng)24h,細菌懸液,稀釋涂平板,單孢子懸液,誘變處理,挑取單菌落200個,搖瓶初篩50株,挑出高產(chǎn)斜面,留種保 藏菌種,傳種斜面,搖瓶復篩5株,挑出高產(chǎn)菌株,放大罐試驗，中試考查,大型投產(chǎn)試驗,誘變篩選過程 中的致死率、突變率、正變率、高產(chǎn)率、投產(chǎn)率,二、新誘變方法-航天育種,所謂航天育種是利用空間環(huán)境高真空、微重力和強輻射的特