1、分子生物學實驗三,2020/8/18,Contents,2020/8/18,聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）,常規(guī)PAGE 不連續(xù)PAGE SDS-PAGE 固相pH梯度IEF(IPG-IEF) 雙向電泳,2020/8/18,凝膠聚合原理,化學聚合 以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑，使丙稀酰胺、甲基雙丙稀酰胺發(fā)生連鎖反應(yīng)形成網(wǎng)狀的聚合物。 光聚合,核黃素B1 還原型 游離基 聚合反應(yīng),光照,O2,2020/8/18,凝膠的孔徑,單體和雙體在凝膠中的總濃度,a+b,V, 100%,T,雙體占總濃度的百分含量，即交聯(lián)度,b,ab, 100%,C,a，Acr的質(zhì)量（g）

2、 b，Bis的質(zhì)量（g） V，溶液的體積（ml）,C6.5-0.3T T：520,孔徑大小,2020/8/18,蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系,凝膠濃度的選擇,2020/8/18,不連續(xù)PAGE的分離效應(yīng),濃縮效應(yīng) 分子篩效應(yīng) 電荷效應(yīng),可分離： 1. 電荷性質(zhì)與密度相近的但分子量有差別 2.分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷與密度有差別 的分子 3.電荷性質(zhì)、分子量大小相近，但構(gòu)型不同,2020/8/18, 濃縮效應(yīng),1.緩沖液與凝膠的離子成分和pH值不同。Cl-，Gly-，蛋白質(zhì)離子?？炻x子遷移快慢的差別造成電場強度與電導率的變化。低導電區(qū)和高導電區(qū)。蛋白質(zhì)樣品遷移率在快慢離子之間，壓縮聚集

3、成一條窄帶。 2.兩層凝膠的孔徑不同：濃縮膠為大孔膠，分離膠為小孔膠,2020/8/18,分子篩效應(yīng),移動界面到達濃縮膠和分離膠界面時，凝膠的pH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的解離迅速增加，直至完全解離出 gly-,其分子量小，遷移超過蛋白質(zhì)分子。而喪失夾擊的作用；同時，凝膠的孔徑變小，降低了蛋白質(zhì)的遷移率。故蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和pH 值中泳動，依其分子量的大小而分開。,2020/8/18,電荷效應(yīng),蛋白質(zhì)所帶的凈電的性質(zhì)和電荷量與分子的遷移率的關(guān)系，在同一電場強度中，在單位時間內(nèi)各分子遷移的距離的差別而到達分離。,2020/8/18,重組蛋白在原核生物中 誘導表達的SDS-PAGE鑒定

4、(B菌),2020/8/18,實驗原理,SDS-PAGE：消除電荷對蛋白質(zhì)樣品遷移率的影響，電泳遷移率取決于蛋白質(zhì)的分子量大小。 SDS是一種陰離子去垢劑，溶液中帶負電荷。 SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)解聚為單一多肽。 蛋白質(zhì)多肽與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復合物，形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊。,2020/8/18,影響因素,溶液中SDS單體的濃度大于1mmol/L時大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，如果單體濃度低于0.5 mmol/L，兩者的結(jié)合比僅為1: 0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋

5、白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:3 樣品緩沖液的離子強度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低，通常是10100mmol/L 用SDS處理樣品同時用巰基乙醇或DTT處理，完全還原蛋白質(zhì)內(nèi)的二硫鍵，使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。,2020/8/18,實驗試劑和器材,1.材料： 低分子量標準蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌動蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制劑 MW=20,100 雞蛋清溶菌酶 MW=14,400 2. 試劑（略）,2020/8/18,12分離膠的制備：15ml dd

6、H2O 4.8 ml 30%凝膠儲存液 6.0 ml 分離膠緩沖液（pH8.8） 3.8 ml 10 SDS 150 l 10AP 150 l 10TEMED 100 l,2020/8/18,濃縮膠的制備：5ml ddH2O 3.34ml 凝膠儲存液 0.83ml 濃縮膠緩沖液（pH6.8） 0.63ml 10 SDS 50l 10AP 50 l 10TEMED 100 l,2020/8/18,操作步驟,1. 將干凈玻璃板在灌膠支架上固定好.固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾 壞玻璃板.2.按比例在燒杯中配好分離膠,用滴管快速加入,之后加少許蒸餾水封膠,靜置3040min.配制凝膠要迅速

7、, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝膠無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免凝膠不均勻.,2020/8/18,操作步驟,封水的目的是為了使分離膠上沿平直，并隔絕空氣，促使凝膠聚合過程；凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面.4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干, 按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入分離膠面上,迅速插入樣梳,靜置30min.樣梳需平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平.,2020/8/18,操作步驟,5. 拔出樣梳。插入電泳槽，倒入緩沖液體，用緩沖液沖洗樣品孔要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.6、用微量移液器距槽底三分之一處進樣,加樣前,樣品在沸水中加熱10

8、分鐘。 注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣品下沉時會發(fā)生擴散. 為避免邊緣效應(yīng),最好選用中部的孔上樣.,2020/8/18,操作步驟,8.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在80V，當進入分離膠后改為150V，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。 9.凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，取出凝膠，考馬斯亮藍染色，做好標記后準備蛋白印跡。 剝膠時要小心,保持膠完好無損.,2020/8/18,注意事項,沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近 一定要催化充分，使之完全聚合 集中處理，實驗中全部的膠專門收集到一起，在一個特殊標明的容器中保存，統(tǒng)一處理。 聚丙烯酰胺通常認為無毒，

9、但是也要小心操作，因為其中可能留下少量沒有聚合的單體。,2020/8/18,重組DNA的酶切分析 目的基因非變性PAGE鑒定,2020/8/18,1. 實驗目的和要求 學習和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶切分析和DNA非變性PAGE鑒定的操作方法，并理解限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵工具，非變性PAGE是高分辨率分離鑒定小分子雙鏈DNA片段的有效方法。,2020/8/18,2. 相關(guān)基礎(chǔ)知識 限制性核酸內(nèi)切酶(Restriction Endonuclease，RE)：是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶

10、等一起稱為工具酶。RE不僅是DNA重組中重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定。,2020/8/18,1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象 2) 核酸限制性內(nèi)切酶的類型、命名法 3) 核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性 4) 同裂酶和同尾酶 5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素,2020/8/18,1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象,限制與修飾系統(tǒng)是細胞的一種防衛(wèi)手段。 各種細菌都能合成一種或幾種核酸內(nèi)切酶，用來限制外源DNA存在于自身細胞內(nèi)，但細胞自身的DNA不受影響，因為細胞內(nèi)還合成了一種修飾酶，能對自身的DNA進行修飾，限制性酶對修飾過的DNA不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。,

11、2020/8/18,2)限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性 按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類： 型 型* 型,2020/8/18,第一類（I型）限制性內(nèi)切酶: 能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大。,2020/8/18,第二類(II型)限制性內(nèi)切酶: 能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類RE的識別和切割的核苷酸都是專一的,因此,是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或

12、6個核苷酸，少數(shù)也有識別5個、7個、8個、9個、10核苷酸的。 II型RE的識別順序是回文對稱順序。酶的切割可有兩種結(jié)果：平頭末端、粘性末端。,2020/8/18,第三類（ III型）限制性內(nèi)切酶: 也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應(yīng)用于基因克隆。,2020/8/18,第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫； 第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。,Hind ,Haemop

13、hilus influenzae d株 流感嗜血桿菌d株的第三種酶,EcoR I is from Escherichia coli.,3）限制性核酸內(nèi)切酶的命名法,2020/8/18,同裂酶： 有時兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，有時其差別只在于當識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如Hpa和Msp的識別順序都是5GCG_G3，如果其中有5-甲基胞嘧啶，則只有Hpa能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同裂酶（同切酶或異源同工酶）。,4） 同裂酶和同尾酶：,2020/8/18,+,BamH,+,Bst,2020/8/18,同尾酶 有些限制性內(nèi)切酶

14、雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,2020/8/18,可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生一個新的酶切位點。如Xba1、Nhe1以及Spe1切割的DNA序列不同，但均給出相同的“CTAG”粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新的4核苷酸的酶切位點，即 Bfa1的酶切位點。,2020/8/18,5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素 (1) DNA的純度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反應(yīng)的溫度； (4) DNA的分子結(jié)構(gòu)； (5) 溶液中離子濃度及種類； (6) 緩沖液的 pH值。,2020/8/18,Hind III 1ul BamH I 1ul 10X Buffer 2 ul Plasmid DNA 6-8 ul ddH2O 10-8 ul *緩沖液隨不同的酶而不同。,置于37水浴酶切1-2hr（7h）。,質(zhì)粒DNA的酶切（自提質(zhì)粒）,實驗步驟：,2020/8/18,DNA酶切片段的非變性PAGE鑒定,凝膠的配制：10 ml 30 凝膠儲存液 2.67 ml 5TBE緩沖液（pH8.8） 2.0 ml ddH2O