1、第六章 生物大分子相互作用 分析技術(shù),基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,劉 蕓,第一節(jié) 生物大分子相互作用分析的意義 第二節(jié) 常見的生物大分子相互作用分析方法 第三節(jié) 生物大分子相互作用分析新進展（FRET、SPR）,主要內(nèi)容,真核生物細胞 eukaryotic cell 原核生物細胞 prokaryotic cell,細胞結(jié)構(gòu) cell,引言,原核生物細胞結(jié)構(gòu),引言,動物細胞,植物細胞,細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核,真核生物細胞結(jié)構(gòu),引言,細胞中的大分子 Macromolecules in Cells,The approximate composition of a bacterial cell.,引言,分子水

2、平,DNA sequence,Proteins Structure Function,?,All Cell,第一節(jié) 生物大分子相互作用分析的意義,基因表達的調(diào)控層次,Protein complex,Signaling net work,生命機制,蛋白質(zhì)組學(xué)的分類,表達蛋白質(zhì)組學(xué) Quantitative study of protein expression between samples that differ by some variable 結(jié)構(gòu)基因組學(xué) Goal is to map out the 3-D structure of proteins and protein comple

3、xes 功能蛋白質(zhì)組學(xué) To study protein-protein interaction, 3-D structures, cellular localization and PTMs in order to understand the physiological function of the whole set of proteome.,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列特點 蛋白質(zhì)進化過程和保守序列 蛋白質(zhì)表達譜 蛋白在細胞內(nèi)的定位及其相關(guān)聯(lián)的細胞器或結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況 了解與其相關(guān)聯(lián)的其他細胞蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)信息的不同層次,蛋白質(zhì)同源二聚體(homodimer) 蛋白質(zhì)異源二聚體(het

4、erodimer) 蛋白質(zhì)多聚體(polymer) 蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物(protein-DNA complex) 蛋白質(zhì)-脂質(zhì)復(fù)合物(protein-lipid complex) 蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物(protein-RNA complex) DNA-DNA復(fù)合物(DNA-DNA complex) ,生物大分子復(fù)合物的類型,第二節(jié) 生物大分子相互作用分析技術(shù),1. 研究思路 2. 分類 3. 技術(shù)介紹,生物大分子相互作用分析研究思路,鑒定與目標(biāo)分子相互作用的所有可能大分子,詳細描述其生物功能及相互作用對其功能的影響,鑒定出相互作用且在生理狀態(tài)下得到了驗證和合理的解釋,GST 融合蛋白技術(shù)(G

5、ST pull-down) 免疫共沉淀(Immunoprecipitation, Co-IP ) 串聯(lián)親和純化(Tandem Affinity Purification，TAP) 酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid) 噬菌體展示(Phage display) 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位(Co-localization) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET) 表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR) ,生物大分子相互作用分析技術(shù),1.GST融合蛋白技術(shù) （GST pull-down a

6、ssay）,基于重組蛋白表達純化技術(shù)的體外分析系統(tǒng),基本原理：是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當(dāng)一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。,GST：谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase),GST pull-down assay Purification of protein,G

7、lutathione column,Glutathione bead,GST fusion protein,Tags Pull-Down 方法的組成,R,tag,bait,prey,Resin樹脂,Bait誘餌蛋白,Prey捕獲蛋白,Tags 標(biāo)簽（GST, His, Flag, HA, MBP）,Pull-down experiment,Wash,Add prey,Wash,Elution,Analysis,Bait,Prey,Controls,Add prey,Wash,Elution,Analysis,S C,SDS-PAGE gel,實驗設(shè)計思路,GST,X,Y,谷胱甘肽-瓊脂糖微珠,

8、細胞裂解物,tube,4下孵育2h,GST融合蛋白,GST,X,Y,+,實驗流程,GST pull-down 應(yīng)用,鑒定未知相互作用的蛋白 鑒定預(yù)測的或已知的相互作用,GST pull down驗證兩種已知蛋白質(zhì)（X-Y）的相互作用,舉 例,2. 免疫共沉淀（ immunoprecipitation，Co-IP ）,非常有效地用于鑒定細胞內(nèi)生理上的蛋白質(zhì)相互作用的分析技術(shù),免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。,基本原理：當(dāng)細胞在非變性條件下被裂解

9、時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。,實驗設(shè)計思路,實驗流程,SDS-PAGE,傳統(tǒng)方法,交聯(lián)方法,基礎(chǔ)：細胞在非變性條件下裂解時，完整細胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)之間的結(jié)合保持下來。 要求：在一系列操作過程中保持蛋白質(zhì)復(fù)合體不變,缺點：可能檢測不到細胞內(nèi)處于動態(tài)平衡中的低親和與瞬間的相互作用,存在著免疫球蛋白的污染，需要培養(yǎng)大量的細胞 局限：僅應(yīng)用于從細胞中溶解出來仍存在于生理復(fù)合物中的蛋白質(zhì),Co-IP 應(yīng)用,鑒定已知蛋白質(zhì)相互作用的檢測 鑒定新蛋白質(zhì)間的相互作用,免疫共沉淀驗證兩種已知蛋白質(zhì)的相互作用

10、,Y-GFP Y-GFP,+X-HA,IP: HA control IgG,Anti-GFP,Anti-GFP,Anti-HA,Y-GFP,input,舉 例,3.串聯(lián)親和純化（Tandem Affinity Purification，TAP）,a. One-step affinity purification b. Two-step affinity purification (tandem affinity purification),Affinity purification (immunopurification),融合了標(biāo)準(zhǔn)生化純化和免疫共沉淀策略的極為有效的快速純化蛋白質(zhì)復(fù)合物的方

11、法,串聯(lián)親和純化技術(shù)的優(yōu)勢,與傳統(tǒng)的生化純化方法相比,與免疫共沉淀方法相比,使用恒定的標(biāo)簽和標(biāo)準(zhǔn)純化條件避免了每次都要設(shè)計新純化方案的問題,多步驟純化降低了細胞高豐度蛋白質(zhì)以及免疫球蛋白的背景污染,雙親和標(biāo)簽：,ProA（葡萄球菌蛋白A 的兩個免疫球蛋白IgG結(jié)合單位） CBP（鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽）,實驗設(shè)計思路,實驗流程,靶蛋白結(jié)合于IgG珠子,充分洗滌后，在TEV蛋白酶作用下洗脫結(jié)合物,鈣離子存在下，將首次洗脫物中的蛋白質(zhì)結(jié)合于鈣調(diào)蛋白包被的珠子上,充分洗滌后，加入EGTA洗脫結(jié)合物,4. 酵母雙雜交（ yeast two-hybrid system ）,基于在轉(zhuǎn)錄水平上的直接在酵母細胞內(nèi)檢測

12、蛋白質(zhì)之間相互作用的遺傳學(xué)方法,基本原理： 基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。,前者可識別DNA上的特異序列， 并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游， 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用， 啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開， 仍具有各自的功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白蛋白的相互作用。,典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子， 如GAL4都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcription-activating d

13、omain，AD）。,酵母雙雜交（ yeast two-hybrid system ）,實驗設(shè)計思路,Target: 未知蛋白或?qū)⒀芯繉ο?+ DNA binding domain,Bait: 已知蛋白 + activation domain,Target 與Bait可互換,轉(zhuǎn)入同一個酵母菌中,Yeast Two-Hybrid Assay,優(yōu)勢：,酵母雙雜交方法的優(yōu)勢及缺陷,采用酵母菌株 敏感度高 蛋白折疊 易于篩選 應(yīng)用范圍廣,酵母雙雜交方法的應(yīng)用,高靈敏度地檢測蛋白蛋白的相互作用 確定蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域或重要活性位點 尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白 尋找具有藥物治療作用的小分子肽 尋找控制

14、蛋白相互作用的化合物 蛋白相互作用圖譜的繪制,舉 例,酵母雙雜交前準(zhǔn)備工作,雙酶切驗證,21kb 5kb 3.5kb 2kb 1.5kb,M 1,M:marker 1:pGBKT7-BD-X,構(gòu)建誘餌質(zhì)粒,誘餌蛋白的表達,檢測誘餌蛋白是否有毒性,1 2 3,Western blot 1.Yeast 2.BD-yeast 3.X-BD-yeast,酵母生長曲線 1.未轉(zhuǎn)化酵母 2.BD-酵母 3.X-BD-酵母,酵母雙雜交結(jié)果,SD/-Trp/-Leu,-Trp/-Leu/-His/-Ade +3-AT （20mM）,舉 例,SD/-Trp/-Leu,Gal4-BD+Y-AD,X-半乳糖苷酶藍白

15、斑顯色分析,舉 例,X-BD+Y-AD,X-BD+gal4-AD,Gal4-BD+Y-AD,gal4-BD+gal4-AD,酵母雙雜交測序結(jié)果,酵母雙雜交得到的陽性克隆子質(zhì)粒經(jīng)過DNA測序，由NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索cDNA編碼的蛋白質(zhì),舉 例,5.噬菌體展示技術(shù)（Phage display）,基于將某個蛋白與其遺傳信息之間直接聯(lián)系的篩選方法,噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。到目前為止，人們已開發(fā)出了單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)、T

16、4噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)。,特 點,該技術(shù)的主要特點是將特定分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi)，即在噬菌體表面展示特定蛋白質(zhì)，而在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結(jié)構(gòu)基因。另外，這項技術(shù)把基因表達產(chǎn)物與親和篩選結(jié)合起來，可以利用適當(dāng)?shù)陌械鞍讓⒛康牡鞍谆蚨嚯奶暨x出來。,Used for cloning foreign genes among other applications Proteins and peptides are fused to the Capsid (surface) of the phage The combination of the phage and

17、peptide is known as a Fusion Protein,實驗設(shè)計思路,phages,Filamentous phages M13 Fd F1 Others T4 ,Filamentous phages,Infect many gram-negative bacteria Circular single stranded DNA genome About 6.4kb.p. Long, flexible tube structure about 1m long and 6.5nm in diameter Reproduced and secreted from infected

18、bacteria without cell killing or lysis (lysogenic phage),(a) Adenovirus. (b) Rotavirus. (c) Influenza virus (courtesy of George Leser). (d) Vesicular stomatitis virus. (e) Tobacco mosaic virus. (f) Alfalfa mosaic virus. (g) T4 bacteriophage. (h) M13 bacteriophage.,M13 噬菌體顆粒結(jié)構(gòu),M13噬菌體的生活史,其裂解周期為： 1)吸附

19、(adsorption) 2)侵入(entory) 3)復(fù)制（生物合成biosynthesis） 4)成熟(maturation) 5)裝配(assembly) 6)釋放(release),絲狀噬菌體的基因及蛋白結(jié)構(gòu),http:/www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572005000100001&script=sci_arttext,pIII (406aa, 58copies) pVIII (50aa, 2700 copies) pVI (112aa, 58copies),載體的插入位點,pIII 和pVIII 噬菌體展示系統(tǒng),T7噬菌體展示篩選系統(tǒng),實驗

20、流程,優(yōu)點： A. 高通量的淘選：將靶標(biāo)分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫（噬菌體的數(shù)量可達1011 PFU），利用抗原-抗體的特異性親和力將與抗體結(jié)合的噬菌體吸附在固相載體上，不能結(jié)合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來，如此反復(fù)數(shù)輪擴增、淘選，即可將有用的基因從多達百萬以上的噬菌體克隆中分離出來。 B. 可用于模擬表位的篩選 ：利用噬菌體展示技術(shù)得到模擬表位的報道較多模擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應(yīng)，例如利用乙肝病毒的模擬表位免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的乙肝病毒抗體。 C. 易于純化 重組噬菌體的純化步驟簡單、不要求昂貴的試劑與設(shè)備

21、，在一般的實驗室條件下就可以完成。 缺點： 首先，目前所建的肽庫容量只能達到109，要想構(gòu)建大片段的肽庫很困難。其次，需要解決肽庫的多樣性問題。第三，少數(shù)多肽由于疏水性過強，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。,噬菌體展示系統(tǒng)的應(yīng)用及優(yōu)缺點,6、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位（cellular co-localization）,基于細胞內(nèi)綠色蛋白示蹤技術(shù)的蛋白質(zhì)間相互的研究方法,綠色熒光,羅丹明染色,重 疊,相 差,舉 例,細胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位研究兩種已知 蛋白質(zhì)時空表達關(guān)系,舉 例,第三節(jié) 生物大分子相互作用分析新技術(shù),1、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance e

22、nergy transfer，F(xiàn)RET）,能夠?qū)τ诩毎械牡鞍踪|(zhì)間相互作用或?qū)ψ饔眠M行實時原位分析的檢測方法,供體熒光素 受體熒光素,FRET現(xiàn)象,FRET: The Size,當(dāng)一個熒光分子(又稱為供體分子)的熒光光譜與另一個熒光分子(又稱為受體分子)的激發(fā)光譜相重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減。FRET 程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)，一般為710 nm 時即可發(fā)生FRET；隨著距離延長，F(xiàn)RET呈顯著減弱.,實驗設(shè)計,Interaction,FRET的能量供體和受體,滿足條件：,供體受體的激發(fā)光譜要分得足夠開； 供體的發(fā)射光譜與受

23、體的激發(fā)光譜要重疊； 供受體的發(fā)射光譜要足夠分開。,FRET的能量供體和受體,均相檢測（無分離和洗滌步驟） 實時連續(xù)地觀察活細胞的動態(tài)變化,FRET技術(shù)的優(yōu)勢,FRET應(yīng)用的類型,FRET應(yīng)用范圍,酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆的復(fù)證 蛋白質(zhì)核酸相互作用 酶活性分析蛋白酶、磷酸激酶 鈣流檢測、離子通道研究 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究,FRET應(yīng)用的局限性,信噪比經(jīng)常不佳，通常為1：1 -背景主要來自受體被直接激發(fā)的信號,檢測儀器的靈敏度、分辨率以及計算機影像采集和分析軟件的能力,2、表面等離子共振技術(shù)（surface plasmon resonance，SPR）,適合于多種類型分子并且無需借助

24、標(biāo)記物可以實現(xiàn)對復(fù)合物直接實時測定的方法,SPRimagerII,基本原理：基于表面等離子共振（SPR）技術(shù)來實時跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標(biāo)記物。實驗時先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用的分子溶于溶液流過芯片表面。檢測器能跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合、解離整個過程的變化。,SPR 現(xiàn)象,表面等離子共振（SPR）是一種物理現(xiàn)象，當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質(zhì)界面（比如玻璃表面的金或銀鍍層）時，可引起金屬自由電子的共振，由于電子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱。其中，使反射光在一定角度內(nèi)完全消失的入射角稱為SPR角。SPR隨表面折

25、射率的變化而變化，而折射率的變化又和結(jié)合在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比。因此可以通過獲取生物反應(yīng)過程中SPR角的動態(tài)變化，得到生物分子之間相互作用的特異性信號。,SPR 角度掃描曲線,SPR angle,傳統(tǒng)檢測原理,SPR angle shift as basis of measurement,SPR imaging 檢測原理,Fixed angle, fixed wavelength,D%R,Reflectivity change as basis of measurement,SPRimager 系統(tǒng),Rotating Stage,流動相（含待分析物）,Gold-coated glass

26、 SPRchip,p-pol light,棱鏡,分子探針陣列,GWCs “SPR Imaging” 技術(shù),Bioarray Terminology,SPRchip,glass,gold,attachment chemistry,Biosensor,Analyte,Probe,Monitoring Changes: Difference Images,=,SA+Bi m-PEG n-PEG SA SA,Probe Array,Probe Array + BiotinT7,Difference Image: signal due to binding of BiotinT7 to Streptavidin,A,B,A,B,-,Monitoring Changes: Image + Chart,Value of Real-Time Monitoring,Protein Array,End of Experiment,Ag SA Con,End-point measurements miss all the action,優(yōu)點：分子無需標(biāo)記； 高通量（蛋白質(zhì)芯片） 檢測對象類型廣泛 可實現(xiàn)實時檢測 可進行相互作用動力學(xué)分析,SPRimager 系統(tǒng),靈活的陣列形式,Rapid methods development Manual spot