1、第二章 基因工程載體和工具酶 Chapter II vectors and Tools enzyme for genetic engineering,【載體（ Vector）】基因工程操作中，把能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具叫載體。,【工具酶】是基因重組技術(shù)不可缺少的工具，主要用于核酸分子的切割、連接、聚合、修飾、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、磷酸酶和磷酸激酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等。,基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到擴(kuò)增和表達(dá)，而目的基因本身無法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)、不易進(jìn)入受體細(xì)胞、不能穩(wěn)定維持，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細(xì)胞”來實現(xiàn)

2、。,【載體】能載帶微量物質(zhì)共同參與某種化學(xué)或物理過程的常量物質(zhì)，在基因工程操作中，把能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具叫載體。三種最常用的載體是細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和植物病毒。,（1）載體必須是復(fù)制子。 具有復(fù)制起始 點(diǎn)，最好要有 較高的自主復(fù)制能力。 （2）有選擇性標(biāo)記，如抗Kan、抗Amp （3）有一段多克隆位點(diǎn) 外源DNA插入其中，不影響其復(fù)制 （4）分子量小，拷貝數(shù)多 （5）容易從宿主細(xì)胞中分離純化,（1）載體必須是復(fù)制子。 最好要有較高的自主復(fù)制能力。 【復(fù)制子（replicon）】是DNA復(fù)制時從一個DNA復(fù)制起點(diǎn)開始最終由這個起點(diǎn)起始的復(fù)制叉完成的片段。像E.coli

3、質(zhì)粒DNA獨(dú)立復(fù)制的單位均為復(fù)制子。,（2）有選擇性標(biāo)記 抗生素抗性標(biāo)記基因:標(biāo)記基因是與外源目的基因構(gòu)建在同一表達(dá)載體上，一起轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞，而后在特定條件下幫助篩選出已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。,藍(lán)白篩選： pUC19等載體攜帶細(xì)菌lac操縱子中的lacZ基因編碼，-半乳糖苷酶N端狀146個氨基酸的段落，當(dāng)培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)物IPTG和Xgal時，lacZ 基因被誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的-半乳糖苷酶N端肽與宿主菌表達(dá)的C端肽互補(bǔ)而具有-半乳糖苷酶活性（質(zhì)粒和宿主編碼的肽段各自都沒有酶活性，兩都融為一體而具酶活性，稱為-互補(bǔ)， -complementation），半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；,轉(zhuǎn)化,空載體,

4、大腸桿菌受體菌,pUC19產(chǎn)生Lac Z 的N端146個氨基酸的多肽,大腸桿菌產(chǎn)生Lac Z 的C端的多肽,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),LacZ（ -半乳糖苷酶）,X-Gal,藍(lán)色產(chǎn)物,水解反應(yīng),在lacZ 中間又插入了一段人工設(shè)計合成的DNA序列，其中密集多個常用的限制性核酸內(nèi)切酶的位點(diǎn)，使外來的基因和序列能很方便地被插入此位置，當(dāng)外來序列插入后則破壞了lacZ 編碼的半乳糖苷酶活性，生長的菌落就呈白色，這種顏色標(biāo)志的變化就很容易區(qū)分和挑選含有和不含有插入序列或基因的轉(zhuǎn)化菌落，稱為藍(lán)白篩選,插入外源片段后的載體,大腸桿菌受體菌,pUC19產(chǎn)生Lac Z 的N端146個氨基酸被打斷的多肽,大腸桿菌產(chǎn)生L

5、ac Z 的C端的多肽,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),無LacZ產(chǎn)生,X-Gal,白色產(chǎn)物,無水解反應(yīng)發(fā)生,（3）有一段多克隆位點(diǎn) 多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site, MCS），是包含多個（最多20個）限制性酶切位點(diǎn)（restriction site）的一段很短的DNA序列。也稱為多位點(diǎn)接頭（polylinker），是基因工程中常用到的載體質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)配置序列。MCS中，每個限制性酶切位點(diǎn)通常是唯一的，即它們在一個特定的載體質(zhì)粒中只出現(xiàn)一次。,（4）分子量小，拷貝數(shù)多。 （5）在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，容易從宿主細(xì)胞中分離純化。,克隆載體: 克隆一個基因或DNA片斷 表達(dá)載體: 用于一個基

6、因的蛋白表達(dá) 整合載體: 把一個基因插入到染色體組中,(1)按功能分,A.【克隆載體】克隆一個基因或DNA片斷，如T載體等。 pUCm-T載體 (pUCm-T Vector) ：是用于克隆含有A末端PCR產(chǎn)物的理想載體?？梢酝ㄟ^藍(lán)白斑篩選有插入片斷的重組克隆。,TA克?。?許多高溫DNA聚合酶，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物3-末端都帶有一個突出堿基A；pUCm-T載體是兩端各帶有一個突出堿基T的雙鏈線性質(zhì)粒，與PCR產(chǎn)物可準(zhǔn)確地形成環(huán)狀質(zhì)粒DNA； PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體形成環(huán)狀質(zhì)粒DNA的過程叫TA克隆。,B.【表達(dá)載體】用于一個基因的蛋白表達(dá)。常用的有原核表達(dá)載體（如，pQE 3.0等）和真核表

7、達(dá)載體(如，pQE 3.1（/-）等)。,真核表達(dá)載體：綠色熒光蛋白載體pEGFP-C3(Green Fluorescent Protein，GFP),pEGFP-C3載體 pEGFP-C3載體是一種把異源性蛋白質(zhì)融合至EGFP C端的哺乳動物表達(dá)載體，為Clontech公司的產(chǎn)品。 含有巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動子，SV40 Poly A尾，pUC復(fù)制起始點(diǎn)（原核）和SV40復(fù)制起始點(diǎn)（真核），20個多克隆位點(diǎn)，具有篩選標(biāo)志卡納霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因。 異源性蛋白與EGFP閱讀框融合克隆入pEGFP-C3，形成的表達(dá)重組體在CMV啟動子啟動下，表達(dá)EGFP和目標(biāo)蛋白的融合蛋白。該融合蛋白保持了EGFP的熒光特性，可對融合蛋白進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi)定位。,EGFP融合蛋白在胞質(zhì)中表達(dá),真核表達(dá)載體：綠色熒光蛋白載體pEGFP-C2,紅色熒光蛋白表達(dá)載體 pVisionRFP-C