1、.,DNA重組質(zhì)粒的構建,醫(yī)學生物所 病毒免疫室,.,基因克隆 gene cloning 應用酶學的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復制能力的DNA分子（重組體），繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細菌或細胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細菌或細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝。 核心技術：DNA重組技術 （ recombinant DNA technique ）,.,基因克隆的基本程序： 分 切 接 轉(zhuǎn) 篩 PCR 酶切 連接 轉(zhuǎn)化 phage; viral; BAC; YAC 根據(jù)用途分：克隆載體；原核生物表達載體；真核生物表達載體 根據(jù)與宿主的關系分：整合性載體、非整合

2、性載體 基因工程中用得最多的是plasmid載體。下面介紹幾種常見的載體。,.,載體的基本結(jié)構單元： 1.復制起點 2.克隆位點 3.篩選標記 其他條件： 4.適當大小 5.易于操作：包括宿主、轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、分離純化、重組等等。,.,質(zhì)粒(Plasmid),質(zhì)粒是獨立于宿主細胞（如細菌）染色體之外的可進行復制和遺傳的遺傳單位-雙鏈閉合環(huán)狀超螺旋DNA分子。是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小從1K-200Kb。,.,通常質(zhì)粒含有某些染色體沒有的基因，負責編碼某些功能蛋白，這些功能并不是細菌生存所必需的，但在一定環(huán)境下，可對細菌宿主的生存有利。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對抗生素的抗性（R因子）、產(chǎn)生抗生

3、素、降解復雜有機化合物、產(chǎn)生大腸桿菌素（大腸桿菌素因子col）、腸毒素及限制酶、修飾酶等。 質(zhì)粒存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。它們復制時利用宿主細胞復制自身染色體的同一組酶系。,.,.,質(zhì)粒DNA的特征,質(zhì)粒復制依賴宿主細胞的復制機器，但可以獨立復制。 （單拷貝或多拷貝：緊密型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒） 嚴緊型：這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞嚴格控制之下的，與寄主細胞的復制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個細胞中只有一份或幾份拷貝； 松馳型：這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下的，每個細胞中含有10-200份拷貝,.,不相容質(zhì)粒攜帶復制子基本相似，復制系統(tǒng)也相同，在復制和分配

4、到子細胞的過程中相互競爭。 質(zhì)粒DNA所編碼的基因產(chǎn)物賦予細菌某些性狀特征。 質(zhì)粒并非細菌生存所必不可少的遺傳物質(zhì)，可以在細菌間轉(zhuǎn)移與丟失。 質(zhì)粒可自行失去或經(jīng)人工處理而消失 可有幾種質(zhì)粒同時共存在于一個細菌內(nèi)，但同群質(zhì)粒有不相容性（同群質(zhì)粒具有同源性，可以產(chǎn)生相同的阻遏蛋白，故彼此間有相互抑制作用，不能共存于同一細胞）,.,（四）人工構建質(zhì)粒的基本元件,啟始復制子：使質(zhì)粒在宿主細胞中能夠復制 抗性基因：用于篩選陽性克隆。 多克隆位點：插入外源基因。 對于表達載體還需要啟動子、多聚A尾等. 易于操作：包括宿主、轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、分離純化、重組等等。,.,pBR322 plasmid 是一個克隆載

5、體，作為一個克隆載體最基本的要求都具備： 復制起點:Ori 克隆位點:EcoR I; Hind III;Bam HI; Sal I 篩選標記:Ampr。,.,T-vector PCR產(chǎn)物亞克隆載體,.,TVector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體，由pUC18載體改建而成的。在pUC18載體的多克隆位點處的Xba I 和Sal I 識別位點之間插入了EcoR V 識別位點，用EcoR V 進行酶切反應后，再在兩側(cè)的3端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶反應時都有在PCR產(chǎn)物的3末端添加一個“A”的特性,所以用本制品可大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。

6、T-vector 克隆PCR產(chǎn)物時用高效連接液Ligation Solution I 可以在極短的時間內(nèi) (30分鐘1小時) 完成連接反應，大大地方便了實驗操作。 用途 克隆PCR產(chǎn)物。 對克隆后的PCR產(chǎn)物使用M13 primers進行DNA測序。,.,.,原核生物表達載體 Bacterial expression vector,.,復制起點 克隆位點 篩選標記 啟動子 轉(zhuǎn)錄終止序列 核糖體結(jié)和位點：起始密碼子ATG和SD序列（翻譯識別）,原核生物表達載體的基本結(jié)構單元包括：,.,.,.,真核生物表達載體 （mammalian expression vector),.,真核生物表達載體的結(jié)構

7、單元,復制起點（真核和原核） 克隆位點 篩選標記(原核和真核標記） 增強子/啟動子 PolyA 終止信號,.,.,Location of Features PCMV IE: CMV IE enhancer: 1-659 CMV IE promoter: 669-750 Intervening sequence (IVS): 890-1022 T7 RNA polymerase promoter: 1067-1085 Multiple cloning site: 1085-1137 T3 RNA polymerase promoter: 1158-1137 SV40 fragment conta

8、ining polyadenylation signal: 1167-1388 f1 origin of replication: 1483-1938,.,EGFP expression cassette: 2002-3455 SV40 enhancer/early promoter: 2002-2420 EGFP structural gene: 2449-3168 Kozak consensus translation initiation site: 2442-2452 Start codon (ATG): 2449-2451; Stop codon: 3166-3168 Inserti

9、on of Val at position 2: 2452-2454 GFPmut1 chromophore mutations (Phe-64 to Leu; Ser-65 to Thr): 2731-2735 His-231 to Leu mutation (A-T): 3143 Bovine growth hormone (BGH) gene fragment containing polyadenylation signal: 3182-3455 SV40 origin of replication: 2318 Ampicillin resistance (b-lactamase) g

10、ene: 3449-4709 Start codon (ATG): 3849-3451 Stop codon (TAA): 4707-4709,.,噬菌體載體,噬菌體(phage) 外源DNA：923kb 常用：EMBL 系列、 gt 系列、charon系列 粘性質(zhì)粒(cosmid)： DNA的 cos區(qū)+質(zhì)粒，雙鏈環(huán)狀DNA，克隆容量：4050kb M13噬菌體,.,.,.,噬菌體(phage) 特點：一種能感染大腸桿菌的病毒，野生型為雙鏈線狀DNA分子，長度48.5kb, 分子兩端各有一個12bp組成的粘性末端, 感染大腸桿菌后,線狀DNA通過粘性末端互補連接成環(huán), 連接處稱COS位點。

11、1. 本身有復制體系; 2. 中間(J-N間) 是生長非必需區(qū), 可被其它外源DNA取代;,.,3. DNA在體外可包裝成病毒顆粒, 感染效率高; 4. 載體容量大,可裝入大片段外源DNA (20kb); 5. 可人工加入多克隆位點; 6. 篩選容易噬菌斑篩選; 7. 主要用于DNA文庫構建.,.,插入型載體含單一的限制性酶切位點，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文庫構建； 取代型載體含某一限制性酶的兩個切點，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因組DNA文庫構建。,.,.,粘性質(zhì)粒(cosmid) 是一種人工改造的載體,雙鏈環(huán)狀DNA， 含有DNA的 cos區(qū)+質(zhì)粒，克隆容量：

12、40 50kb 1. -DNA的COS位點; 2. 質(zhì)粒的復制起點和抗藥性標記 (Ampr); 3. 多種單一的酶切位點.,.,cosmid較小, 約4 6kb, 可容納40-45kb的外源DNA,由于噬菌體DNA包裝時包裝蛋白識別的只是DNA 粘性末端附近的一小段順序，因此只要一個質(zhì)粒接上此粘性末端順序，再加上外源DNA片段使其長度為野生型DNA大小的75105%，重組體可象噬菌體一樣進行外殼裝配, 形成噬菌體顆粒, 感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒高得多, 進入宿主細胞后, 只能象質(zhì)粒一樣擴增, 并依賴抗藥性被篩選.,.,.,優(yōu)缺點: 1.克隆效率高; 2.可利用質(zhì)粒DNA的方式擴增; 3.可克隆較

13、大DNA片段; 主要用于真核基因的克隆, 基因組文庫構建 4.缺點: 產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。,.,M13噬菌體 一種絲狀單鏈噬菌體，閉環(huán)正鏈ssDNA，全長6.5kb, 感染大腸桿菌后, ssDNA 轉(zhuǎn)變?yōu)閐sDNA, 可用作克隆載體.最大優(yōu)點：產(chǎn)生單鏈DNA, 可制備單鏈DNA探針.,.,.,構建基因文庫的克隆載體,粘粒(Cosmid) 細菌人工染色體(BAC) 酵母人工染色體(YAC) P1噬菌體人工染色體(PAC),.,P1及YAC載體 酵母人工染色體，可容納外源基因片段長達200kb-1000kb，含有酵母第4號染色體的著絲粒和自主復制序列CEN4、ARS1，作為端粒的Tel序列，選擇性標志U

14、RA3、TRP1和SUP4，能在酵母中穩(wěn)定的復制，常用于大的染色體基因組DNA文庫構建。,.,一個典型的YAC系列載體,.,病毒載體 DNA病毒在細胞中具有較高的拷貝數(shù)，并有較強的啟動子，因而是基因工程載體的理想候選者。諸如： SV40（猴腎病毒） Epstein-Barr病毒(EBV病毒) 牛乳頭瘤病毒（BPV） 昆蟲桿狀病毒（baculovirus),.,.,由于存在容量小、宿主范圍小等缺陷，天然SV40病毒作為載體很少被使用，多數(shù)載體為帶有來自SV40中轉(zhuǎn)錄元件的質(zhì)粒型載體 SV40增強子、啟動子和復制子，可以在哺乳動物細胞中產(chǎn)生高效的組成型表達。 SV40 polyA信號，可以對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)

15、物進行加工，穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性。 Zeocin抗性基因，可作為大腸桿菌及哺乳動物細胞的選擇標記。Zeocin抗性基因在大腸桿菌中的合成由EM-7啟動子控制，在哺乳動物細胞中的表達由CMV啟動子控制，既可用于瞬時表達，也可用于篩選穩(wěn)定表達的細胞系。 f1復制子，可產(chǎn)生單鏈DNA。 ColE1復制起始位點，使質(zhì)粒可在大腸桿菌中復制擴增。,.,EB病毒,EB病毒,.,Epstein-Barr病毒(EBV病毒)是人類皰疹病毒, 可轉(zhuǎn)化人的B淋巴細胞，在轉(zhuǎn)化細胞中以染色體外附加體形式存在。EBV病毒的順式作用因子oriP可以在帶有EBV DNA并表達具有反式作用的EBNA1抗原的貼壁細胞中維持附加體DN

16、A分子的存在，因而能作為構建表達載體的元件，該類載體也主要用于建立帶有多拷貝外源基因的細胞系?？稍诙喾N細胞中表達，可表達基因組DNA和cDNA,可為表達細胞系。,.,Comparison of different cloning vectors Vector type Length of cloned DNA Plasmid 20 kb Phage 25 kb Cosmid 45 kb P1 vector 100 kb BAC 100 Kb (bacterial artificial chromosome) YAC 1,000 kb (yeast artificial chromosome),

17、.,DNA重組操作過程,.,一把特殊的剪刀限制性內(nèi)切酶,30多年前，當人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進行研究時，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。細菌可以抵御新病毒的入侵，而這種“限制”病毒生存的辦法則可歸功于細胞內(nèi)部可摧毀外源DNA的限制性內(nèi)切酶。這些酶可在特定位點切開DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達非常有用的工具。 阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎,.,限制性內(nèi)切酶的特點： 限制性內(nèi)切酶的形式多樣，從大小上來說，它們可以小到如PvuII（157個氨基酸），也可以比1250

18、個氨基酸的CjeI更大 除了某些病毒以外，限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)現(xiàn) 在已純化分類的3000種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過250種的特異識別序列。,.,限制性內(nèi)切酶的命名,限制性內(nèi)切酶命名的次序如下： A 用3個字母代表來源的生物，如大腸桿菌（ Escherichia coli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 B 1個字母或阿拉伯數(shù)字代表菌株（EcoR、Hind） C 1個羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序（EcoRI、Hind III ）,.,限制性內(nèi)切酶的分類,按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素限制性內(nèi)切酶可劃分為三大類

19、： I型限制性內(nèi)切酶 II型限制性內(nèi)切酶 III型限制性內(nèi)切酶,.,I型限制性內(nèi)切酶是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多個亞基的蛋白復合體。其特點是識別位點和切割位點不一致，沒有固定切割位點。它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈，不產(chǎn)生確定的限制片段和明確的電泳條帶，因而不具備實用性。 III型限制性內(nèi)切酶也是兼有限制-修飾兩種功能的酶。雖然有特異切割位點，但它們在識別位點之外切開DNA鏈，很少能產(chǎn)生確定的切割片段，因而不具備實用價值，也沒有人將其商業(yè)化。,.,II型限制性內(nèi)切酶在其識別位點之中或臨近的確定位點特異地切開DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶，因此是三種 限制性內(nèi)切酶

20、中唯一用于DNA分析和克隆的一類。II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列截然不同。實際上，從已知的情況上看，這些酶很可能是在進化過程中各自獨立產(chǎn)生的，而非來源于同一個祖先。,.,II型限制性內(nèi)切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I這樣在識別序列中進行切割的酶。這一類酶是構成商業(yè)化酶的主要部分。 大部分這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而識別的是對稱序列；但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。 一些酶識別連續(xù)的序列（如EcoR I識別GAATTC）；而另一些識別不

21、連續(xù)的序列（如Bgl I識別GCCNNNNNGGC）。 限制性內(nèi)切酶的切割后產(chǎn)生一個3羥基端和一個5磷酸基團。它們的活性要求鎂離子的存在，而相應的修飾酶則需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。這些酶一般都比較小，亞基一般都在200-300個氨基酸左右。,.,一些概念,粘末端和平末端 同尾酶 同裂酶 同識異切酶 消化 星號活力,.,限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端： 鈍性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end),.,同尾酶,有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶，可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生一個新

22、的酶切位點。 如Xba(TCTAGA)、Nhe (GCTAGC） 、Spe (ACTAGT)切割的DNA序列不同，但均給出相同的“CTAG”粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新的4核苷酸的酶切位點，即 Bfa （CTAG) 的酶切位點。,.,有時兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，其差別只在于當識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如Hpa和Msp的識別順序都是5CCGG3，如果其中有5-甲基胞嘧啶，則只有Hpa能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同裂酶（同切酶或異源同工酶）。,同裂酶,.,限制性內(nèi)切酶在非標準反應條件

23、下,也能切割一些與其特異識別序列類似的序列。 星號活性的識別形式常對標準識別順序中兩側(cè)的堿基沒有特異性。因此, 盡量采用規(guī)范的實驗步驟, 應用推薦的反應條件。,星號活力,.,克隆（有時與甲基化酶聯(lián)用） 鑒定（基因片斷大小、正反向） 檢測突變（識別位點，限制酶切圖譜的多態(tài)性RFLP） 制作Marker,限制性內(nèi)切酶的應用,.,限制性內(nèi)切酶的使用,一個標準的酶切反應包含： DNA 合適的酶緩沖液 蛋白酶 為了提高酶切效率，可加入BSA。,.,1、建立一個標準的酶切反應 通常，10個單位的內(nèi)切酶可以切割1g不同來源和純度的DNA。一個50l的反應體系中，1l的酶在1X Buffer終濃度及相應溫度條

24、件下反應1小時即可降解1g已純化好的DNA。如果加入更多的酶，則可相應縮短反應時間；如果減少酶的用量，對許多酶來說，相應延長反應時間（不超過16小時）也可完全反應。 一般說來，線性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1ug lambdaDNA，需要1-2單位的酶，而酶切1ug質(zhì)粒DNA，需要3-5單位的酶。,應用中的注意點,.,2. 選擇正確的酶 不言而喻，選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個相應的識別位點。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的（3或5突出端），也可以是平端的片段。粘端產(chǎn)物可以與相容的其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接，而所有的平端產(chǎn)物都可以互相連接,.,3、加酶 內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應當立即置于冰上

25、。酶應當是最后一個被加入到反應體系中（在加入酶之前所有的其它反應物都應當已經(jīng)加好并已預混合）。酶的用量視在底物上的切割頻率而定。,.,4、DNA 待切割的DNA應當已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應該是酶切要考慮到的因素,.,5、緩沖液 對于每一種酶都提供相應的最佳緩沖液，可保證酶活性。使用時的緩沖液濃度應為1X。有的酶要求100g/ml的BSA以實現(xiàn)最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響,.,6、 反應體積 內(nèi)切酶活力單位的定義是：1小時內(nèi)，50l反應體積中，降解1g的底物DNA所需的酶為一個活力單位。因此酶：DN

26、A的反應比例可以由此確定。較小的反應體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下，要注意酶的體積不要超過總體積的10%（一般酶都貯存于50%的甘油中）,.,7、混合 這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應完全，必須使反應液充分混合。我們推薦用槍反復吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩！,.,8、反應溫度 大部分酶的反應溫度為37；從嗜熱菌中分離出來的內(nèi)切酶則要求更高的溫度。一般為50-65不等,.,9、反應時間 1酶活單位的定義時間為1小時。如果加入的酶較多，可以相應地縮短反應時間；反之，如果加入的酶量較少，也可以延長時間以使反應達到完

27、全,.,10、終止反應 如果不進行下一步酶切反應，可用終止液來終止反應。我們使用如下反應終止液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚藍（10l/50l反應液）。如果要進行下一步酶切反應，可用熱失活法終止反應（65或85，20分鐘）。熱失活并不能適用于所有的酶。此外，酚/氯仿抽提也可以用于終止反應。,.,11、貯存 大部分酶應貯存于-20。少部分酶則須在-70長期保存。10X BUFFER 和100X BSA于-20保存。BSA不能與Buffer混合后保存，否則將會出現(xiàn)BSA沉淀,.,12、穩(wěn)定性 大部分酶在推薦的保存緩沖液里在-20條件下十分穩(wěn)定。高于-20條件下穩(wěn)

28、定性將有所降低,.,13、對照反應 如果發(fā)現(xiàn)DNA底物不能被成功切開，可以進行對照實驗以查明原因。具體方法如下： 將不加內(nèi)切酶的底物DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶的對照DNA（有多個已知酶切位點）同時進行反應。若實驗結(jié)果表明底物DNA降解，則說明DNA在純化過程中或反應液里引入了核酸酶污染；若實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整，而對照DNA被成功切開，則可以排除酶質(zhì)量的原因，此時可以將對照DNA和待切底物DNA混合起來再次進行反應，以確定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在（通常是鹽、EDTA或酚），則混合物里的對照DNA也無法被切開,.,使用限制性內(nèi)切酶的一般步驟,A）測試酶切DNA的量 B）

29、計算完全酶切所需的酶量。為使終體積中甘油的濃度低于8%，計算能加的酶量，最多能加終體積的10%（甘油的濃度為5%）。 C）10X反應液的體積應為終體積的1/10；10X反應液的體積不應小于酶的體積。 D）加入計算好的DNA，10X反應液，酶。 加入水到終體積（20-50 ul），輕輕混勻，在適當?shù)臏囟认卤亍Ｒ话忝傅淖钸m溫度為37 oC，但有例外。應查訊分析說明。,.,舉例,質(zhì)粒DNA （2ug/ ul） 5 ul 10X反應液 5 ul 內(nèi)切酶 2ul dH2O 38 ul 總體積 50 ul 37 oC保溫2-3小時。 應最后加酶。,.,提高限制性核酸內(nèi)切酶對低純度DNA制劑的反應效率，可

30、采用的方法,增加限制性核酸內(nèi)切酶的用量，平均每微克底物DNA可高達10個活性單位甚至更多些。 擴大酶催化反應的體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳南♂尅?延長酶催化反應的保溫時間。,.,能否在一次反應中用很多的限制性內(nèi)切酶？ 可以，一般而言，甘油濃度超過8%對酶切有抑制。有些酶在高的甘油濃度中會產(chǎn)生星號活力。限制性內(nèi)切酶提供在50%的甘油中，故10 ul反應體積中不應加入超過1.6 ul的酶。,.,6.雙酶切： 根據(jù)重組的需要，有時需要用雙酶切（單酶切：由于只有一種酶切，載體片段很容易相互粘連，形成空載體），這樣重組效果會更好。 雙酶切時要先分析兩種酶且的條件，根據(jù)兩種酶切的緩沖液要求，有三種情況,

31、.,7.載體的酶切： 酶切條件與外源DNA沒有區(qū)別。載體多位環(huán)狀DNA,如果只有一個酶切位點，用單酶切。目前商業(yè)化載體均有多克隆位點，含有多個酶切位點，可以進行多種選擇和取舍。,.,酶切產(chǎn)物回收,離心柱回收純化酶切產(chǎn)物DNA片段 純化問題：純化PCR產(chǎn)物割膠還是柱式，推薦柱式，因為割膠手法不準，很容易割下大塊的膠，影響純化效率。現(xiàn)在的柱式純化號稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個堿基肯定也會被純化掉了。所以，PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應用柱式純化。,.,數(shù)據(jù)庫,限制性內(nèi)切酶的數(shù)據(jù)庫 其中含有已知的所有限制性內(nèi)切酶的完整表，包括識別的序列，甲基化的敏感性，商業(yè)信息和參考文獻。 Company: TAKARA Fermentas,.,連接酶（ligase),主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。催化相鄰DNA鏈的5-P和3-OH末端以磷酸二酯鍵結(jié)合。E. coli DNA 連接酶催化DN