1、第一章 RNA的提取和cDNA的合成,RT-PCR原理及應用,應用：基因檢測、基因轉錄產物的分析、 合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統(tǒng),一、RNA的提取,RNA易降解，在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染，并設法抑制其活性。 RNA酶穩(wěn)定，并廣泛存在，如各種組織、人的皮膚、手指、試劑、容器等。,采取的措施： 1、全部實驗過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2小時以上。 3、不能用高溫烘烤的材料如塑料容器、試劑等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理，然后高壓滅菌以消除殘存的DEPC 。,注意事項： 1、DEPC與氨水溶

2、液混合會產生致癌物。 2、DEPC能與胺和巰基反應，因而含Tris和DTT（二硫蘇糖醇）的試劑不能用DEPC處理。 3、Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。 4、配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開封的試劑。,總RNA提取方法（試劑盒）： 異硫氰酸胍苯酚法（Trizol 法） 原理：首先用強變性劑異硫氰酸胍裂解細胞，同時使核蛋白復合體中的蛋白變性，釋放出核酸。釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH時溶解度不同，分別位于整個體系中的中間相和水相，從而使DNA和RNA分離開來。進一步通過有機溶劑來抽提沉淀RNA，就可以得到純凈的RNA。,二、cDNA的合

3、成,反轉錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶 種類：兩種 1、禽類成髓細胞病毒（AMV）反轉錄酶 包括兩個多肽亞基（最適溫度42） 活性：依賴于RNA的DNA合成，依賴于DNA的DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。,2、鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶 只有單個多肽亞基（最適溫度37） 活性：依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA雜交體中的RNA的能力較弱，且對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉錄酶差。 MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。,cDNA引物 種類： 1、隨機六聚體引物：不特異的引物 體系中所有RNA分子全部充

4、當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。,2、Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的引物 絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物（12-18核苷酸）與其配對，僅mRNA可被反轉錄。 由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體引物得到的cDNA在數(shù)量和復雜性方面均要小。,3、特異性引物 用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。,第二章 聚合酶鏈式反應（PCR）,一、PCR基本步驟,三個步驟：

5、 1、變性(Denature)：雙鏈DNA目的片段在94下解鏈。 2、退火(Anneal)：兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對。 3、延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度(72左右)下，以目的DNA為模板進行合成。,二、PCR反應中的主要成分,引物：好壞是PCR成敗的關鍵。 設計原則： 1、引物長度約為16-30bp 2、引物中G+C含量通常為40%-60%，粗略估計引物的解鏈溫度Tm4(G+C)+2(A+T)，且接近72最好。 3、四種堿基應隨機分布，在3端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)引發(fā)錯誤。,

6、4、引物3-端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應，以減少由于密碼子擺動產生的不配對。 5、在引物內，尤其在3-端應不存在二級結構，且3-端盡量不用T，尤應避免連續(xù)2個或2個以上T，因為T引發(fā)錯配的幾率高。,6、兩引物之間尤其在3-端不能互補，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產量。兩引物間最好不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。 7、引物5-端對擴增特異性影響不大，可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點等，通常應在5-端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。,8、引物不與模板結合位點以外的序列互補。 引物濃度： 一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1

7、.0mol/L。 引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體，過低 則降低產量。,4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)： dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分裝，-20貯存。 一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200mol/L。 當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。 4種dNTP的濃度應該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。,Mg2+： Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產物的特異性以及引物二聚體的形成等。 通常Mg2+濃度范圍為0.5-2mmol/L。對于一種新的PC

8、R反應，可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進行預備實驗，選出最適的Mg2+濃度。,在PCR反應混合物中，應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團，例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+濃度的物質，以保證最適Mg2+濃度。 模板： PCR中模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好)。,就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。 一般反應中模板量為102-105個拷貝。擴增單拷貝基因，需要0.1g的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA。多拷貝基因擴增用量更少。 模板過多可能增加非

9、特異性產物。DNA中的雜質也會影響PCR的效率。,Taq DNA聚合酶： 一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5 130min，95 40min， 97 5min。 Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74 30min，摻入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。 Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率，一般PCR中出錯率為210-4核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應注意。,所用的酶量適當。酶量過多會使產物非特異性增加，過少則使產量降低。 反應結束后，需要滅活Taq DNA聚合酶。 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR產物經(jīng)酚/氯仿抽提，乙

10、醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100加熱10min。目前已有直接純化PCR產物的Kit可用。,反應緩沖液： 反應緩沖液一般含10-50mmol/L TrisCl (20下pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl和適當濃度的Mg2+。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。 加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA)，可穩(wěn)定酶活性；加入T4噬菌體的基因32蛋白對擴增較長DNA片段有利。 各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的緩沖液。,三、PCR反應參數(shù),變性 在第一輪循環(huán)前，在94下變性5-10m

11、in非常重要，它可使模板DNA完全解鏈。 變性不完全，往往使PCR失敗，因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復性，減少DNA產量。 一般變性溫度與時間為94 1min。,在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時間主要是為使反應體系完全達到適當?shù)臏囟取?對于富含GC的序列，可適當提高變性溫度。但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。,退火 引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成、引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。 一般當引物中G、C含量高，長度長并與模板完全配對時，應提高退火溫度。退火溫度越高，所得產物的特異性越高。,實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值

12、約低5。 通常退火溫度和時間為37-55，1-2min。 退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應中所需時間主要是為使整個反應體系達到合適的溫度。,延伸 延伸反應通常為72，接近于Taq DNA聚合酶的最適反應溫度75。 實際上，引物延伸在退火時即已開始，因為Taq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20-85。 延伸時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。 在一般反應體系中，Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。,延伸時間過長會導致產物非特異性增加。 但對很低濃度的目的序列，則可適當增加延伸反應的時間。 一般在擴增反應完成后，都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應，以獲得盡可能完整

13、的產物，這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。,循環(huán)參數(shù) 一般而言，25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會使PCR產物中非特異性產物大量增加。 通常經(jīng)25-30輪循環(huán)后，反應中Taq酶已經(jīng)不足。 如果此時產物量仍不夠，需要進一步擴增，可將擴增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板，重新加入各種反應底物進行擴增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，擴增水平可達109-1010。,在擴增后期，由于產物積累，使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線，產物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺效應。 平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。 因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應

14、，減少非特異性產物。,四、PCR產物的純化,酚/氯仿法 Kit法,五、PCR產物的克隆,利用T-Vector克隆 Taq DNA聚合酶會在3-端加上多余的非模板依賴堿基，而且對A優(yōu)先聚合，所以PCR產物末端的多余堿基大部分都是A。 利用這一特點，可以經(jīng)限制酶切割產生的平末端用酶加上dT或ddT，使載體與PCR產物末端互補并進行連接。,粘性末端連接 利用引物中附加在5端的限制酶位點，直接將PCR產物經(jīng)適當?shù)南拗泼盖懈詈螽a生粘性末端，與載體連接，產生重組DNA。 如果上、下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點，經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。,第三章 DNA酶切及凝膠電泳,一、DNA的限制性內切酶分析,

15、類限制性內切酶 識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列。 類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產生平末端的DNA片段。 如，Sma：5-CCCGGG-3,有的切割位點在對稱軸一側，產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端。 如，EcoR切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。 5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5,酶切反應 單酶切：各種酶緩沖液、反應溫度不同 如，BamH反應溫度為30 雙酶切：緩沖液不同，反應溫度為37。 若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內切酶必須首先使用，隨后調節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內切酶水解。

16、酶切時保護堿基的個數(shù),二、瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質，其密度取決于瓊脂糖的濃度。 瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度200bp至50kb的DNA片段。 瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。,在電場中，帶負電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由多種因素決定： DNA的分子大小 線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。,瓊脂糖濃度 一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃

17、度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關系。,DNA分子的構象 相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，而線狀雙鏈DNA移動最慢。 電源電壓 在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。電壓增加時，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。,離子強度影響 在沒有離子時(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導率最小，DNA幾乎不移動。 在高離子強度時(如誤加10電泳緩沖液配制凝膠)，則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。,第四章 其它工具酶,一、連接酶（連接反應）,類型與用途 1、T4 DNA連接酶 催化相鄰D

18、NA鏈的5-P末端和3-OH末端之間形成磷酸二酯鍵。它不僅可以催化粘性末端DNA之間的連接，也可以催化平滑末端DNA之間的連接。 用途：（1）DNA片斷和載體DNA的連接。 （2）DNA片斷和Linker DNA的連接。,2、大腸桿菌DNA連接酶 催化相鄰DNA鏈的5-P末端和3-OH末端之間形成磷酸二酯鍵。一般只能催化突出末端DNA之間的連接，如果要催化平滑末端DNA之間的連接反應，需要有PEG及高濃度一價陽離子的存在。 用途：（1）DNA片斷和載體DNA的連接。 （2）DNA片斷和Linker DNA的連接。,連接要求與結果,反應體系（ 20l ） 載體DNA 1l 外源DNA 3l 10

19、T4 DNA Ligation Buffer 2l T4 DNA Ligase 1l ddH2O 13l 載體DNA與外源DNA的摩爾比通常為13左右。 反應條件：16 8-14h，通常過夜即可。,二、堿性磷酸酶（去磷酸化反應）,類型： SAP（蝦的堿性磷酸酶）、BAP（大腸桿菌C75堿性磷酸酶）、CIAP（小牛腸堿性磷酸酶），其中BAP、CIAP應用最廣泛。 用途： 去除載體DNA 5-末端的磷酸基團，防止自身環(huán)化反應。,反應體系（ 50l ） 載體DNA 20l 10Alkaline Phosphate Buffer 5l Alkaline Phosphatase 2l ddH2O 23l

20、 反應條件：5-突出端37 30min，對于平末端及5-凹端使用BAP 應在5560條件下反應。,三、DNA聚合酶（補平反應）,類型與用途 1、Klenow Fragment（大腸桿菌DNA聚合酶I大片斷） 具有53的DNA聚合酶活性，對于單鏈DNA具有35的外切核酸酶活性，但較弱。 用途：雙鏈DNA5-突出端的平滑化。,2、T4 DNA聚合酶 具有53的DNA聚合酶活性和35的外切核酸酶活性，且后者比Klenow Fragment外切核酸酶活性高1001000倍。 用途：雙鏈DNA5-突出端和雙鏈DNA3-突出端的平滑化。,反應體系：（20l） DNA 5-突出端 12l 10Buffer

21、2l Klenow Fragment 1l dNTPs 0.5l ddH2O 4.5l 雙鏈DNA3-突出端的平滑化反應不需加dNTPs即可。 反應條件：37 30min,第五章 感受態(tài)細胞的制備與轉化,受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，它可以容忍外源DNA分子進入其體內并穩(wěn)定地遺傳給后代。 受體細胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法，CaCl2，KCl等化學試劑法)的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Compenent cells)。,轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。 為了提高轉化

22、效率，要考慮幾個重要因素： 1、細胞生長狀態(tài)和密度： 不要用經(jīng)過多次轉接或儲于4的培養(yǎng)菌，最好從70或-20甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。,細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。 DH5菌株的OD600 為0.5時，細胞密度在5107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時比較合適。 密度過高或不足均會影響轉化效率。,2、質粒的質量和濃度： 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA。 轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉化效率就會降低。 一般情況下，DNA溶液的體積不應超過感

23、受態(tài)細胞體積的5%。,3、試劑的質量： 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。 4、防止雜菌和雜DNA的污染： 整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌。,第六章 質粒DNA的提取,質粒載體的特性,質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。 質粒具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。 質粒的不相容性：利用同一復制系統(tǒng)的不

24、同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在。,理想的克隆載體的特性： 1、分子量小、多拷貝、松馳控制型 2、具有多種常用的限制性內切酶的單切點 3、能插入較大的外源DNA片段 4、具有容易操作的檢測表型。 常用的質粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如pBR322、pUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。,質粒分離的基本步驟,1、培養(yǎng)細菌使質粒擴增 2、收集和裂解細胞 采用溶菌酶可破壞菌體細胞壁，SDS和Triton X-100可使細胞膜裂解。經(jīng)處理后，細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小

25、的線性片段。,當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環(huán)狀的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。 3、分離和純化質粒DNA,在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產生其它形式的質粒DNA。 如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNA。 如果質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA。,質粒的提?。▔A裂解法）,試劑配制： 溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L ED