1、基因工程藥物 干擾素的制備,中文名稱： 干擾素 英文名稱： interferon;IFN 定義1： 細胞因子中的一個家族，以干擾病毒復(fù)制而得名。根據(jù)產(chǎn)生細胞不同可分為干擾素、干擾素和干擾素三類。 應(yīng)用學(xué)科： 免疫學(xué)（一級學(xué)科）；免疫系統(tǒng)（二級學(xué)科）；免疫分子（三級學(xué)科） 定義2： 脊椎動物受多種因素(如微生物)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組抗病毒蛋白質(zhì)?？捎绊懠毎倪\動和免疫過程，也可干擾多種病毒的復(fù)制而得此名。干擾素有型和型，以及干擾素樣細胞因子，型干擾素有7種：IFN-、IFN-、IFN-、IFN-、IFN-、IFN-和IFN-，人類沒有IFN-和IFN-；型僅有IFN-。 應(yīng)用學(xué)科： 生物化學(xué)與分子生物

2、學(xué)（一級學(xué)科）；激素與維生素（二級學(xué)科） 定義3： 抑制病毒在細胞內(nèi)增殖的一類活性蛋白質(zhì)。 應(yīng)用學(xué)科： 水產(chǎn)學(xué)（一級學(xué)科）；水產(chǎn)生物病害及防治（二級學(xué)科） 定義4： 因最初發(fā)現(xiàn)某一種病毒感染的細胞能產(chǎn)生一種生物學(xué)活性物質(zhì)可干擾另一種病毒的感染和復(fù)制而得名。是最早發(fā)現(xiàn)的細胞因子。根據(jù)干擾素產(chǎn)生的來源和結(jié)構(gòu)不同可分為干擾素、干擾素和干擾素三類。 應(yīng)用學(xué)科： 細胞生物學(xué)（一級學(xué)科）；細胞免疫（二級學(xué)科）,干擾素概述,干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制；同時還可增強自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞和T淋

3、巴細胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強抗病毒能力。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。,干擾素發(fā)現(xiàn)發(fā)展歷程 干擾素的生產(chǎn)企業(yè) 干擾素的藥理作用、臨床應(yīng)用及不良反應(yīng) 干擾素的制備路線,50年前，英國的病毒學(xué)家艾力克伊薩克斯(Alick Isaacs)在流感病毒研究時發(fā)現(xiàn)，在雞胚中注射滅活流感病毒后，雞胚細胞中生成了一種物質(zhì)，這種物質(zhì)可以反過來“干擾(interfere)”流感病毒的生長，于是就將這種物質(zhì)稱為干擾素(interferon)。隨著研究的

4、深入，人們發(fā)現(xiàn)它是一個非常重要的細胞因子，不僅具有直接抗病毒作用，更重要的是它還具有免疫增強作用。 干擾素獨具的雙重作用讓科學(xué)家們興奮不已。顯然它具備了成為攻克乙肝的利器的必要條件。但干擾素的人工合成、工業(yè)化生產(chǎn)乃至最后真正為攻克疾病作出貢獻，又經(jīng)歷了漫長而艱辛的過程。,一、干擾素的發(fā)現(xiàn)發(fā)展歷程,早期的干擾素是從人體白細胞中通過純化技術(shù)提取的，不僅量少，且含有很多雜質(zhì)，導(dǎo)致作用有限。直到70年代中期，隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展和基因重組技術(shù)的出現(xiàn)，科學(xué)家們逐漸開始嘗試通過基因重組技術(shù)合成干擾素。1978年，瑞士羅氏公司的科學(xué)家帕斯特卡(Pestka)成功克隆了干擾素cDNA，為后來干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)奠

5、定了基礎(chǔ)。1990年，基因重組技術(shù)正式應(yīng)用于干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)，于是今天所說的“普通干擾素”開始批量生產(chǎn)。但是，普通干擾素也給患者和醫(yī)生帶來困擾：它注射后吸收入血過快且從血液中清除過快會導(dǎo)致很大的血藥濃度波動，濃度過高時會導(dǎo)致較為嚴重的不良反應(yīng)，但濃度過低又會導(dǎo)致病毒重新復(fù)制和反彈；此外，一旦注射了普通干擾素，它廣泛分布于全身，腎臟清除率很高，也極易被免疫系統(tǒng)識別其血清半衰期只有2至5小時，必須頻繁注射用藥，因而干擾素的臨床應(yīng)用受到了很大限制。 到1990年代末2000年代之初，聚乙二醇化(PEG)技術(shù)的出現(xiàn)使干擾素終于成為人類與乙肝斗爭中的真正利器。2002年，羅氏研究生產(chǎn)的聚乙二醇化干擾素

6、-2a(派羅欣)正式上市，聚乙二醇與干擾素的結(jié)合，大大改善了干擾素的藥物特性，使血藥濃度變得更加穩(wěn)定，同時聚乙二醇分子支鏈對干擾素有效成分的保護作用，大大降低了它的抗原性，血清半衰期大大延長可以每周一次注射用藥臨床療效得以明顯提高，副反應(yīng)顯著減少。,干擾素發(fā)現(xiàn)者Alick Isaacs 1957年，英國醫(yī)生Alick Isaacs在進行流感病毒試驗時，發(fā)現(xiàn)雞胚中注射滅活流感病毒后生成了一種物質(zhì)，這種物質(zhì)具有“干擾”流感病毒感染的作用，于是Isaacs將這種物質(zhì)稱之為“interferon”，也就是今天我們所說的干擾素。 干擾素抗病毒作用機理的發(fā)現(xiàn)者Robert M.Friedman 在1966

7、到1971年期間，美國醫(yī)生Robert M.Friedman發(fā)現(xiàn)了干擾素對病毒的抑制作用主要是干擾素干擾了病毒信使RNA功能，而抑制了蛋白的合成。從此，關(guān)于干擾素抗病毒的作用機理的深入研究才被逐漸展開。 干擾素從實驗室到臨床的重要人物Derek C.Burke 美國病毒學(xué)專家Derek C.Burke致力于干擾素的生產(chǎn)流程的研究，并在1980年實現(xiàn)了通過人類白細胞進行干擾素量化生產(chǎn)，雖然這種生產(chǎn)方式無法與基因技術(shù)出現(xiàn)后的生物工程生產(chǎn)方式相比，但對干擾素從實驗室成功地走向臨床卻是有著非常重要的意義。 干擾素免疫調(diào)節(jié)機制的證實者Samuel Baron 美國人Samuel Baron與Isaacs

8、的共同研究證實了干擾素在機體免疫系統(tǒng)對抗病毒感染中的起著非常重要的作用，也正是他們的研究為干擾素在臨床的應(yīng)用提供了更多的證據(jù)，并為干擾素抗病毒的雙重作用機理奠定了基礎(chǔ)。 使干擾素的臨床應(yīng)用成為可能Sidney Pestka 美國科學(xué)家Sidney Pestka在羅氏研究院里成功克隆出了干擾素cDNA，為后來干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。,上海生物制品研究所 北京三元基因工程有限公司 長春海伯爾生物技術(shù)有限責(zé)任公司 深圳科興生物工程有限公司 哈藥集團生物工程有限公司 天津華立達生物工程有限公司 沈陽三生制藥有限責(zé)任公司 安徽安科生物工程(集團)股份有限公司 ,二、干擾素生產(chǎn)企業(yè),干擾素在病毒細胞

9、表面與特殊膜受體結(jié)合發(fā)揮抗DNA和RNA作用，包括對某些酶的誘導(dǎo)作用，阻止受病毒感染細胞中病毒的復(fù)制，抑制這些細胞的繁殖。本品具有免疫調(diào)節(jié)作用，可增強巨噬細胞的吞噬作用，增強淋巴細胞對靶細胞的特殊細胞毒性。 1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，它一般為廣譜病毒抑制劑，對RNA和DNA病毒都有抑制作用。當(dāng)病毒感染的恢復(fù)期可見干擾素的存在，另一方面用外源性干擾素亦可緩解感染。 2.抑制細胞增殖：干擾素抑制細胞分裂的活性有明顯的選擇性，對腫瘤細胞的活性比正常細胞大5001000倍。干擾素抗腫瘤效果可以是直接抑制腫瘤細胞增殖，或通過宿主機體的免疫防御機制限制腫瘤的生長。 3.干擾素對體液

10、免疫、細胞免疫均有免疫調(diào)節(jié)作用，對巨噬細胞及NK細胞也有一定的免疫增強作用。,三、干擾素藥理作用,干擾素防治感冒 干擾素治療非典(SARS) 干擾素治療慢性乙肝(CHB ) 干擾素治療腫瘤 干擾素治療皰疹病毒感染 干擾素對狂犬病毒的作用 干擾素治療亞急性硬化性全腦炎(SSPF ) 干擾素治療多發(fā)性硬化(M S) 及肌萎縮性側(cè)索硬化 ,臨床應(yīng)用,1.全身反應(yīng)：主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和不適。 2.骨髓抑制：在用藥中可出現(xiàn)白細胞、血小板和網(wǎng)狀紅細胞減少。 3.局部反應(yīng)：部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24h后即可消退。 4.其他：脫發(fā)、皮疹、血沉加快、嗜睡、一過性肝損傷。偶見過敏

11、性休克，用藥前應(yīng)做過敏試驗。 5.呼吸困難、肝功能降低、白細胞減少、過敏反應(yīng)、轉(zhuǎn)氨酶和血肌酐升高、全身乏力、脫發(fā)、鼻塞、鼻出血、上皮萎縮、嗜睡甚至癲癇發(fā)作。 6.罕見有抑郁、意識障礙、體重減輕、皮疹、禿發(fā)、給藥局部反應(yīng)、感覺異常、呼吸困難、單純皰疹、眼痛、心動過速、焦慮、瘙癢、鼻出血、咳嗽、高血壓、感覺減退、腹痛、咽炎等。 7.心血管系統(tǒng)不良反應(yīng)特別是心律失常似與原有心血管疾病及以前有心臟毒性的治療有關(guān)。劑量大于每天1000萬U時，出現(xiàn)肝功能指標AST、ALT上升，粒細胞和血小板計數(shù)減少，停藥或減量時可迅速恢復(fù)。 其他尚有白細胞減少和血清肌酐、LDH、堿性磷酸酯酶上升。,不良反應(yīng),處理好各種不

12、良反應(yīng)，包括必要時減量、對癥處理或終止治療。 （1）流感樣癥狀的處理：發(fā)熱時可給予乙酰氨基酚或其他解熱鎮(zhèn)痛藥，干擾素用藥時機掌握在就寢前或者傍晚給藥或休息日給藥；多飲水，吃平衡膳食。 （2）頭痛的處理：服用鎮(zhèn)痛藥，盡量避免強光和噪聲，不飲酒、少食富含酷氨酸和苯丙氨酸的食物，限制咖啡因的攝入，保證每日足夠睡眠及充足的水分。 （3）發(fā)熱、乏力、肌肉疼痛的處理：干擾素注射前口服對乙棧氨基酚，或其他非處方退熱藥，就寢前或者傍晚給藥，使患者在睡眠中度地發(fā)熱期；冷敷、熱水浸泡或理療、按摩。 （4）失眠或興奮的處理：保持良好的睡眠衛(wèi)生習(xí)慣，規(guī)律的作息時間，睡前保持放松狀態(tài)，有睡意時才睡覺，限制午睡時間；定期

13、進行鍛煉，限制咖啡因的乙醇的攝入。 （5）脫發(fā)的處理：避免用損發(fā)產(chǎn)品、電吹風(fēng)機、束發(fā)帶和每日洗發(fā)；使用柔和的洗發(fā)劑和護發(fā)劑；避免染發(fā)和燙發(fā)，留短發(fā)或者戴假發(fā)。 （6）食欲減退的處理：保持良好的口腔衛(wèi)生，適當(dāng)?shù)男菹⒑湾憻挘簧倭慷嗖?，多食水果、蔬菜?（7）注射局部反應(yīng)的處理：注射前冰敷注射部位至產(chǎn)生麻木感；注射部位消毒，待乙醇干燥后再注射；藥物達到室溫后注射，以4590進針；不要搓揉注射部位；交替部位注射。 （8）抑郁癥的處理：治前評估心理健康穩(wěn)定性，預(yù)測治療期間癥狀的強度，根據(jù)抑郁的嚴重程度，調(diào)整干擾素劑量或停止治療，需要時可以酌情給予抗抑郁藥。 （9）甲亢的處理：暫停干擾素治療，適當(dāng)給予甲亢

14、藥物治療，疾病穩(wěn)定后可謹慎繼續(xù)治療。,如何應(yīng)對干擾素的不良反應(yīng),體外誘生干擾素制備工藝： Sendai病毒誘導(dǎo)人白細胞 1989年：IFN-n3/Alferon，批準上市 存在問題：產(chǎn)量低：1g IFN，需要 3億ml人血白細胞，來源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價格昂貴，潛在的血源性病毒污染的可能性,四、干擾素的制備路線,干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）,人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝： 1999年：IFN -n1/Wellferon, 批準用于臨床。 優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。 缺點： 活性低，退出臨床應(yīng)用。,干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）,基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝: 上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN

15、 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體 工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程。,干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）,動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝： 上市產(chǎn)品：rhuIFN -1a 1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono) 表達產(chǎn)物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工藝特點：細胞培養(yǎng)，分泌表達 缺點：產(chǎn)量低，成本高,過程嚴格,干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）,宿主：

16、腐生型假單胞桿菌（Pseudomonas putida） 上市產(chǎn)品：IFN -2b/安福隆 表達產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子 結(jié)構(gòu)和生物活性 工藝特點：發(fā)酵周期短（幾個小時），無需變性、復(fù)性過程，獲得有活性產(chǎn)品，純化過程：淘汰抗體親和層析,干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）,基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝,我們生活的環(huán)境是被微生物包圍著的，時時刻刻都要接觸到許多微生物，其中病毒的侵染刺激也不少。科學(xué)家猜測，人的血液細胞里本身就存在干擾素。后來研究證明，這種猜測是有道理的，通過精密的血液分析，在人和許多動物的細胞中都找到了干擾素。 人們最初想到的是，通過血液制取干擾素?？上?，干擾素在血液中的含量實在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干擾素，這種生產(chǎn)方式產(chǎn)量低得可憐，自然價格也就十分昂貴。治療一個病人的費用高達幾萬美元，一般百姓只能望“藥”興嘆，是名副其實的“貴族藥”，干擾素?zé)o法得到普及、推廣。 既然蛋白質(zhì)是干擾素的本質(zhì)，那么把制造成這種蛋白質(zhì)的遺傳基因找出來，轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，讓它們代勞進行大量生產(chǎn)，也許能行。經(jīng)過科學(xué)家的試驗，干擾素的批量生產(chǎn)便成為可能。1980年，終于實現(xiàn)了干擾素的批量生產(chǎn)，這是美國科學(xué)家的杰作，他們利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了生產(chǎn)干擾素的基因工程。 如今，運用基因工程技術(shù)的國家有：美國、日本、法國、比利時、德國、英國