1、動(dòng)物組織或材料中鹽酸克倫特羅殘留的快速elisa檢測(cè)試劑盒產(chǎn)地：比利時(shí)bio-x1. 檢測(cè)原理 8. 工作液的準(zhǔn)備2. 操作時(shí)間 9. 樣品前處理3. 檢測(cè)下限 10. 酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4. 回收率 11. 操作步驟5. 交叉反應(yīng)率 12. 結(jié)果計(jì)算6. 試劑盒的組成 13. 結(jié)果分析7需要設(shè)備及試劑 14.注意事項(xiàng)簡(jiǎn)介： 克倫特羅（clenbuterol）屬于beta興奮劑，是一種高選擇性的興奮劑和激素，具有水解脂肪、合成代謝和對(duì)非條紋肌肉組織的松弛作用。進(jìn)年來(lái)被一些人非法添加到飼料中以提高脂肪型動(dòng)物的瘦肉率和加速動(dòng)物的生長(zhǎng)。當(dāng)用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，其添加量是治療量的510倍，常在動(dòng)物體內(nèi)殘留而

2、給消費(fèi)者帶來(lái)危害。通常，hplc或gc-ms是克倫特羅殘留檢測(cè)的確證方法，但是其前處理步驟費(fèi)用昂貴，而elisa快速檢測(cè)試劑盒因成本低、操作簡(jiǎn)便、速度快、一次檢測(cè)樣本量大、儀器化低，現(xiàn)已成為常規(guī)的篩選方法。1.檢測(cè)原理：測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板上包被有針對(duì)兔igg（clenbuterol抗體）的羊抗體，含有克倫特羅抗原的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記物被加入到小孔中，經(jīng)過(guò)孵育及洗滌步驟后，游離的抗原與抗原酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)，沒(méi)有結(jié)合的抗原酶標(biāo)記物在清洗步驟中被除去，將顯色液加入到孔中并且孵育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色。在450nm處

3、測(cè)量，吸光強(qiáng)度與樣品的克倫特羅濃度成反比。2.操作時(shí)間： 1小時(shí)(30分鐘孵育+30分鐘顯色)3.檢測(cè)下限： 0.1ppb4.回收率：尿樣和血清： 97-110%飼料： 95-100% 肝臟/組織： 90-97%牛奶及奶粉 100%5.交叉反應(yīng)率：clenbuterol (克倫特羅) 100%mabuterol（馬普特羅） 100%mapenterol（馬噴特羅） 100%salbutamal (沙丁胺醇) 8-9%terbutalin (特普他林) 7-8%simarterol(塞曼特羅) 0.1%isoproterenol（異丙腎上腺素） 0.1%fenoterol（非諾特羅） 0.1%6

4、.試劑盒的組成：1) 96孔酶標(biāo)板：12條8孔（包被有抗兔igg）.2) 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液6瓶：1ml /瓶，為clenbuterol水溶液:0.1ng/ml，0.3 ng/ml，0.6 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml.3) 酶聯(lián)結(jié)合物conjugate peroxidase： 6ml 黃蓋4) 抗clenbuterol抗體溶液：anti-clenbuterol antibody 11ml 紅蓋5) 沖洗液（需10倍稀釋?zhuān)﹚ash buffer： 50ml 塑料瓶6) 檸檬酸鹽緩沖液citrate buffer： 25ml 藍(lán)蓋7) 底物溶液chromoge

5、n： 3 ml 黑蓋8) 樣品稀釋液（需20倍稀釋?zhuān)ヾiluent solution: 10ml 綠蓋9) 反應(yīng)終止液stop solution： 6ml 白蓋7.需要設(shè)備及試劑（試劑盒中未提供）設(shè)備：1） 均質(zhì)器2） 振蕩器3） 微孔酶標(biāo)儀（450nm）4） 離心機(jī)5） 20ul，50ul，100ul，200ul微量加樣器6） 免疫親和柱（每根柱子可以至少可以純化120-150個(gè)樣本，也可以用c18柱純化）。試劑：1） 氫氧化鈉2） 0.01m hcl3） 5m鹽酸4） 蒸餾水8.工作液的準(zhǔn)備：1） 洗液：用蒸餾水按（1+9）稀釋2） 樣品稀釋液：將樣品稀釋液用蒸餾水按（1+19）稀釋?zhuān)ㄗⅲ?/p>

6、在使用前再配）。3） 底物溶液：用檸檬酸緩沖液（1+9）稀釋?zhuān)ㄗⅲ簷幟仕峋彌_液本試劑盒內(nèi)有提供，稀釋后的溶液避免光線(xiàn)直射）。注：終止液含硫酸，要小心操作。9.樣品前處理：9.1尿液和血清：（稀釋因子1）尿液和血清不用處理，直接測(cè)定。（如果尿液渾濁，一定要過(guò)濾或離心）9.2肝臟9.2.1（簡(jiǎn)便前處理方法）（稀釋因子3）1） 取1g肝臟樣品，加入2ml0.01m hcl.2） 均質(zhì)5分鐘.3） 檢查ph值是否在6.5-8之間，否則用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié).4） 離心15分鐘3500rpm，或者離心5分鐘13000rpm，轉(zhuǎn)移出上清液備用.9.2.2.（復(fù)雜前處理方法）（稀釋因子1）1） 帶有低脂肪的肝

7、，肉或組織.2） 5g粉碎的樣品于25ml 50mm 鹽酸混合，振蕩15分鐘，以達(dá)到均質(zhì)的目的。3） 稱(chēng)6g均質(zhì)物（相當(dāng)于1g肝臟），加入離心瓶中。4） 1015離心15分鐘4000rpm或更高的轉(zhuǎn)速。5） 轉(zhuǎn)移出上清液至另一個(gè)離心瓶中，加300ul 1m 氫氧化鈉混合15分鐘。6） 加入4ml 500mm 磷酸二氫鉀緩沖液ph3.0，簡(jiǎn)單混合并在4保存至少1.5小時(shí)或過(guò)夜7） 在10-15離心15分鐘，4000g或更高轉(zhuǎn)速。8） 分離全部上清液（應(yīng)該是清亮的），使其升至室溫（20-24），然后用c18柱純化（見(jiàn)c18柱純化步驟）。c18柱純化方法：所有試劑和樣品處理必須在室溫下（20-24）

8、并嚴(yán)格控制過(guò)柱時(shí)的流速。（非常關(guān)鍵）1） 用3ml100%甲醇洗滌柱子，流速為1滴/秒。2） 用2ml洗滌液洗滌柱子（50mm磷酸二氫鉀緩沖液ph3.0）。3） 樣品進(jìn)柱。4） 用2ml洗滌液洗滌柱子（50mm磷酸二氫鉀緩沖液ph3.0）。5） 用正壓去除殘留的液體并用空氣或氮?dú)獯?分鐘干燥柱子。6） 用1ml100%甲醇洗脫樣品，流速為15滴/分鐘。7） 在50-60弱空氣或氮?dú)饬飨峦耆舭l(fā)溶劑。8） 用1ml蒸餾水溶解干燥的殘留物，備用分析。9.3飼料（稀釋因子10）：1) 用乳缽研碎飼料，稱(chēng)1g研碎的飼料樣品加入10ml0.01m的鹽酸，充分混合5分鐘。2) 檢查ph值是否在6.5-8之

9、間，否則用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)3) 離心5分鐘3500rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。（如上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾）4) 直接取上清液進(jìn)行檢測(cè)9.4牛奶和奶粉（稀釋因子50）：1) 取1g奶粉或1ml牛奶于50ml試管中，加3ml（牛奶加2ml）蒸餾水2) 加100ul 5m的鹽酸（調(diào)節(jié)ph至3）3) 升溫至403-5分鐘直至牛奶凝化，離心5分鐘3500rpm4) 加5m氫氧化鈉100ul，加入46.8ml蒸餾水，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)ph值為6.5-8之間5) 離心15分鐘3500rpm，取上清液進(jìn)行檢測(cè)9.5組織樣品（稀釋因子50）：1）1g粉碎的樣品于50ml 試管，加50ml 0.01m

10、 hcl混合，振蕩5分鐘，以達(dá)到均質(zhì)的目的。2) 檢查ph值是否在6.5-8之間，否則用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)3) 離心5分鐘3500rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。（如上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾）4) 直接取上清液進(jìn)行檢測(cè)10.酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：1) 將所有試劑升至室溫20-25，一旦開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，一定要連續(xù)不間斷。2) 所有標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣為減少操作誤差，最好同時(shí)做平行實(shí)驗(yàn)。3) 檢測(cè)樣品建議做平行實(shí)驗(yàn)（可以減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因操作失誤而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。11.操作步驟：（孵育時(shí)間30分鐘）1) 按照所要進(jìn)行測(cè)驗(yàn)的微孔板條，從酶標(biāo)板中取出所需的微孔板條并插入框架內(nèi)。2) 吸取50ul的蒸餾水作為0標(biāo)樣。3

11、) 吸取50ul標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品入各自的微孔內(nèi)。4) 每孔內(nèi)加入50ul酶聯(lián)結(jié)合物，然后再加入100ul 克倫特羅抗體溶液（該反應(yīng)速度快，建議使用多道移液器）。5) 輕輕敲擊微孔板四周，室溫20-25避光孵育30分鐘。6) 傾空微孔板，用250ul沖洗液重復(fù)洗板5次，最后，用力在吸水紙上將殘余液滴拍干（洗板時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)清洗液注滿(mǎn)微孔，翻轉(zhuǎn)微孔板傾空，盡量擠壓微孔板，以防微孔板從框架上脫落）。7) 顯色：每孔加200 ul顯色液，室溫20-25避光孵育30分鐘（顯色液用1體積底物溶液+9體積檸檬酸緩沖液）8) 孵育結(jié)束時(shí)，每孔加50ul反應(yīng)終止液，充分混合，在450nm下讀數(shù)。12.結(jié)果計(jì)算：1)

12、樣品中未知的clenbuterol通過(guò)曲線(xiàn)定量計(jì)算2) 將得到的樣品吸光度值減去所有空白值的平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)液吸光值和樣品吸光度值以及最大吸光度值3) 用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值（b）除以最大吸光度值（b0）再乘以100，最大吸光度值接近于100%的吸光度值百分率：樣品吸光度值（或標(biāo)準(zhǔn)液） b100=（%）最大吸光度值 b0 根據(jù)b/b0的值做出每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的半對(duì)數(shù)曲線(xiàn)，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度就可從曲線(xiàn)上讀出。13.結(jié)果分析：由于樣品在反應(yīng)中經(jīng)過(guò)了預(yù)先稀釋?zhuān)虼烁鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得出的待測(cè)樣濃度一定要再乘以其稀釋因子才能得出其在樣品中的正確含量。（尿液和血清的稀釋因子是1，肝臟的稀釋因子是3，飼料的稀釋因子是10，組織的稀釋因子是50，牛奶和奶粉的稀釋因子是50）14.注意事項(xiàng)：1） 溫度低于20或試劑及標(biāo)品沒(méi)有回到室溫（20-25）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的值偏低。2） 洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)