1、識(shí)別雙鏈DNA 分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。,主要是原核生物,4000種。,1、來(lái)源：,2、種類：,3、作用：,4、結(jié)果：,形成兩種末端,一、 “分子手術(shù)刀” 限制性核酸內(nèi)切酶,二、 “分子縫合針” DNA連接酶,1、種類： 2、作用部位：,兩類,連接黏性末端,Ecoli DNA連接酶,T4 DNA連接酶,磷酸二酯鍵,連接黏性末端和平末端,1、能自我復(fù)制,2、具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn),3、具有遺傳標(biāo)記基因,4、對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害、易分離,三、運(yùn)載體,1、作用：將外源基因送入受體細(xì)胞,2、充當(dāng)運(yùn)載體的條件,3、種類：,質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒

2、,在進(jìn)行基因工程操作中,真正被用作載體的質(zhì)粒都是 在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的,基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù),生物體外,基因,DNA分子水平,人類需要的基因產(chǎn)物,剪切, 拼接, 導(dǎo)入, 表達(dá),基因重組,基因工程的概念,一、目的基因的獲取,1、目的基因主要是指_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子,2、獲取目的基因的常用方法有哪些?,（1）從基因文庫(kù)中獲取,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,（3）人工合成,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心,目的：,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,目的基因+啟動(dòng)子+終止子+

3、標(biāo)記基因,目的基因的 表達(dá)所需物質(zhì)：,(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,轉(zhuǎn)化 ,方法,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過(guò)程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢查是否成功,檢測(cè),鑒定,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法,方法,方法,DNA分子雜交,分子雜交（注意與上不同之處）,抗原抗體雜交,非編碼區(qū),非編碼區(qū),

4、編碼區(qū),RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),外顯子,內(nèi)含子,終止子,基因的結(jié)構(gòu),啟動(dòng)子,原核,真核,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子,內(nèi)含子：,外顯子：,結(jié)構(gòu)基因,外顯子,內(nèi)含子,轉(zhuǎn)錄、加工修飾,mRNA,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,由于原核生物沒(méi)有內(nèi)含子(沒(méi)有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)),動(dòng)物和植物內(nèi)含子的剪接系統(tǒng)不同,所以不能相互剪接內(nèi)含子,所以只能用沒(méi)有內(nèi)含子的cDNA。,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,1.簡(jiǎn)述DNA連接酶和DNA聚合酶的異同。 2.簡(jiǎn)述PCR的名稱、PCR技術(shù)擴(kuò)增的前提、用到的特殊酶是？PCR技術(shù)擴(kuò)增的過(guò)程。 3.基因表達(dá)載體有幾種構(gòu)建方式，在不同的構(gòu)建方式

5、中標(biāo)記基因分別起什么作用. 4.在表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞時(shí)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法分別有哪些優(yōu)缺點(diǎn)。 動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入時(shí)將表達(dá)載體導(dǎo)入什么樣的細(xì)胞，怎么操作？微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵是什么，怎樣完成導(dǎo)入。 5.目的基因和目的基因的產(chǎn)物mRNA檢測(cè)時(shí)用什么作為探針進(jìn)行檢測(cè)，用到了什么原則？,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,原理：在體外進(jìn)行DNA復(fù)制,基因工程的應(yīng)用,植物方面 提高植物的抗蟲、抗病、抗逆性 改良植物的品質(zhì) 動(dòng)物方面 提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度 改善畜產(chǎn)品的品質(zhì) 用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物 用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體 研制藥物 利用工程菌研制藥物 基因治療 取代致病基因、導(dǎo)入能增強(qiáng)人體免疫能力的基因 體

6、外基因治療: 體內(nèi)基因治療:,復(fù)合型免疫缺陷癥,(細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素),遺傳性囊性纖維化病,注意了解乳腺生物反應(yīng)器,簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)工程崛起的原因，蛋白質(zhì)工程的過(guò)程，蛋白質(zhì)工程和基因工程的不同點(diǎn)是什么？,細(xì)胞工程,1概念:,2分類:植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程,在細(xì)胞水平或細(xì)胞器水平上進(jìn)行操作 在分子水平上進(jìn)行操作,細(xì)胞工程操作- 基因工程操作-,小結(jié),植 物 細(xì) 胞 工 程,植物組織培養(yǎng)技術(shù),植物體細(xì)胞雜交技術(shù),原理：,操作過(guò)程：,必要條件：,操作過(guò)程：,原理：,優(yōu)點(diǎn)：,缺點(diǎn)：,1.什么是細(xì)胞的全能性?,3.為什么體內(nèi)細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出全能性，而是分化成為不同的組織、器官？,2.全能性大小比較,

7、受精卵 生殖細(xì)胞 體細(xì)胞,第二組,第一組,植物細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞,基因在特定空間和時(shí)間條件下選擇性表達(dá)的結(jié)果。,具有某種生物_的任何一個(gè)細(xì)胞，都具有_的潛能。,全部遺傳信息,發(fā)育成完整生物體,4.概括細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值對(duì)組織培養(yǎng)過(guò)程的影響！,細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素基本相等時(shí)：,維持愈傷組織的生長(zhǎng),細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素維持在高水平時(shí): 誘導(dǎo)再分化和形成芽原基,細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的比例低時(shí)： 誘導(dǎo)脫分化和形成根原基,5.組織培養(yǎng)時(shí)為什么要向培養(yǎng)基中加入有機(jī)物？脫分化是為什要避光，再分化時(shí)為什么 要有光照？,動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段?,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、 動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)、 動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)、 生產(chǎn)

8、單克隆抗體技術(shù),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。,培養(yǎng)過(guò)程：,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官,細(xì)胞懸浮液,胰蛋白酶,10代細(xì)胞,原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),無(wú)限傳代,單個(gè)細(xì)胞,加培養(yǎng)液,動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,（分解彈性纖維）,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能 最終培養(yǎng)成生物體,1.原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)可能會(huì)出現(xiàn)了哪些現(xiàn)象？,2.什么措施有利于貼壁生長(zhǎng)？,3.什么措施有利于改善接觸抑制？,4.傳代培養(yǎng)特點(diǎn)： 傳代細(xì)胞一般傳至10代就不易傳下去了；少數(shù)可傳至50代（壽命極限）；其中有一些可獲得不死性無(wú)限增殖（突變成癌細(xì)胞）。,一般來(lái)

9、講培養(yǎng)10代以內(nèi)的細(xì)胞保證正常的二倍體核型。,5.能不能用胃蛋白酶代替胰蛋白酶處理細(xì)胞？處理時(shí)間有沒(méi)有要求？為什么？,3、溫度和pH 溫度36.5+（-）0.5度, pH7.2-7.4 4、氣體環(huán)境 O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ）,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件：,1、無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液） 2、營(yíng)養(yǎng) （糖（葡萄糖）、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、血清、血漿等。合成培養(yǎng)基）,注：CO2的加入是為了維持PH，培養(yǎng)一般在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？,獨(dú)特之處有： 1、液體培養(yǎng)基 2、成分中有血清、血漿等,大規(guī)模培

10、養(yǎng)生產(chǎn)生物制品 （病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體） 作為基因工程中的受體細(xì)胞 培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞可以用于檢測(cè)有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性 用于生理、病理等方面的研究 （如篩選抗癌藥物為治療和預(yù)防癌癥及其他疾病提供理論依據(jù)）,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用：,細(xì)胞的全能性,細(xì)胞株、細(xì)胞系,植物體,培養(yǎng)結(jié)果,獲得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物,快速繁殖、培育無(wú)病毒植株等,培養(yǎng)目的,葡萄糖、血清、血漿,蔗糖、植物激素,培養(yǎng)基特有成分,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基性質(zhì),細(xì)胞增殖,原理,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),比較項(xiàng)目,植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,概念：將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育

11、成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。 用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物,核移植,（難度高）,受體細(xì)胞：M期的卵母細(xì)胞,動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物,細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易,體現(xiàn)了動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性,細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核,細(xì)胞核移植,多莉羊的培育過(guò)程,體細(xì)胞核移植的過(guò)程,卵母細(xì)胞去核,體細(xì)胞取核,電刺激使兩細(xì)胞融合,重組細(xì)胞,重組胚胎,新個(gè)體,、在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？,為使核移植動(dòng)物的遺傳物質(zhì)全部來(lái)自有利用價(jià)值的動(dòng)物提供的細(xì)胞。,、用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，為什么？,思考題,3、用于核移植的為什么

12、要選擇減數(shù)第二次分裂中期的細(xì)胞？,選擇減二中期的卵母細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)：體積大，易操作，含有大量的促使細(xì)胞核體現(xiàn)全能性的物質(zhì)和條件。,4、體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？,胚胎移植技術(shù),試管動(dòng)物（嬰兒）培養(yǎng)過(guò)程,受精卵,體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景,1、加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育,2、保護(hù)瀕危物種，增加存活數(shù)量,3、克隆動(dòng)物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白,4、可以作為異種移植的供體，可以用于組織器官的移植,（二）動(dòng)物細(xì)胞融合,1.過(guò)程：,滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面,細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通,細(xì)胞膜連接,細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞 （細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性）,動(dòng)物細(xì)胞融合,物理法 化學(xué)法 生物法,方法,植物體細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合比較,單克隆抗體制備過(guò)程,細(xì)胞融合、篩選,足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群,單克隆抗體,（選擇性培養(yǎng)基）,選擇性培養(yǎng)基： 使親本細(xì)胞不能 存活而雜種細(xì)胞可存活,單