1、流式細胞術(shù)基本原理,陳曉東 產(chǎn)品技術(shù)專員,廣州市珈源醫(yī)學試劑有限公司,流式細胞術(shù),流式細胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選 研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量,2,流式細胞儀的特點,單個細胞/生物顆粒分析 同時多參數(shù)、多熒光分析 高通量檢測/高速度 10000個細胞/秒以上 定性/定量分析 分選特定性狀或功能的細胞 可檢測的樣本種類多樣 (1)外周血，骨髓，細針穿刺，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞

2、 (2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液,3,目前流式細胞儀可以檢測的類別,細菌,浮游生物,DM：0.2m 15m,單核細胞,中性粒細胞,淋巴細胞,紅細胞,4,5,流式細胞儀的基本構(gòu)造,激光發(fā)射器 發(fā)出所需要的波長的激光,前向散射光檢測器,側(cè)向散射光檢測器,光學濾鏡,流動室與液流系統(tǒng)：將細胞單個壓入流動室,信號收集與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),光源與光學系統(tǒng),6,流動室,7,當光子遇到濾片時，光子或通過濾片，或被濾片吸收，或被濾片反射。,光學濾片,8,光學濾片的種類,長通濾片（LP）：630LP 短通濾片（SP）：550SP 帶通濾片（BP）: 488/10,9,10,共有兩類：散射信號與熒光信號 前向角散

3、射信號（FSC） 反映細胞大小 側(cè)向角散射信號（SSC） 反映細胞顆粒度 熒光信號（FL Signals）（FL1、2、3） 胞內(nèi)、胞外染色情況,流式細胞儀可獲取的信號種類,11,FSC和SSC,直方圖,流式細胞儀顯示圖的種類,12,把前向散射光圖和側(cè)向散射光圖的一維圖像在二維圖像上投影，便是我們平常所看到的流式圖。 所以橫坐標表示的是細胞的直徑大小；縱坐標表示的是細胞的復雜程度。 兩者相結(jié)合就能說明細胞種類,散點圖,13,二維等高圖和密度圖,14,假三維圖與三維圖,15,流式細胞儀如何獲取細胞信號？,FSC SSC FL,16,前向角信號（Forward Scatter，F(xiàn)SC）,17,前向

4、角信號：細胞的大小,18,19,側(cè)向角信號（Side Scatter， SSC）,20,21,FL,22,23,FSC、SSC、FL,24,如何分離90角內(nèi)的各種熒光信號？,25,熒光染料,吸收某一波長的光波后能發(fā)射出大于吸收光波長的光波的物質(zhì),PI,488n,600nm,26,熒光染料種類,熒光染料 激發(fā)波長 (nm) 發(fā)射波長(nm) 用途 顏色 FITC 488 525 免疫熒光 綠色 PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 PerCP 488 670 免疫熒光 紅色 PI 488 620 DNA染色 橙紅 ECD 488 620 免疫熒光 橙紅 PeCy5 488 675 免疫

5、熒光 紅色 APC 633 670 免疫熒光 紅色 DAPI 359 462 DNA染色 藍色,27,熒光染料光譜特征,28,熒光分離原則,在流式細胞儀中，一般經(jīng)過LP或SP濾片將熒光大致分開后，再經(jīng)過一BP濾片分離出特征熒光,29,開放式光路 Calibur、Influx,流式細胞儀的光路,30,封閉式光路（Canto、LSR系列、Aria系列）,31,分選,將目標細胞分離并富集，進行后續(xù)研究。 分選純度99%,32,震蕩,33,偏轉(zhuǎn)板,34,幾個概念,信號放大模式 信號類型 CV值 樣本流速 激光延遲 液滴延遲 熒光補償 閾值 門 對照,35,信號放大 PMT將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，調(diào)整PM

6、T的電壓，信號強度將隨之改變,光信號,光電倍增管（PMT）,放大器,電信號,放大器兩種放大方式： 線性放大（lin） 對數(shù)放大（log）,36,線性放大（lin）,按光強度的線性關(guān)系輸出信號.適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物過程的信號，如DNA含量、總蛋白含量等。,37,對數(shù)放大（log）,按光強度的對數(shù)關(guān)系輸出信號.在免疫學測量中通常使用對數(shù)放大。,38,電脈沖信號類型,將與電脈沖信號 強弱相關(guān)的電壓 數(shù)字化 有三類電脈沖信號 高度信號H 面積信號A 寬度信號W,39,CV值,CV值（變異系數(shù)）： 樣品均一度及儀器分辨率的標志,CV值一般2%,40,樣本流速,41,高流速：一般用于定

7、性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低. 低流速：一般用于對分辨率要求較高的分析，如DNA分析。,樣本流速選擇,42,激光延遲（laser delay）,Laser 1,Laser 2,43,液滴延遲（drop delay）,44,顏色補償,采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差。在完成雙色以上熒光標記的樣本時，都需要作顏色補償。,45,FITC主要由FITC的檢測器檢測，但部分光也會進入PE檢測器。如果單染FITC，同時打開PE檢測器，則如圖：,46,閾值,信號放大過程會產(chǎn)生不需要的脈沖信號，通常來自于碎片。通過設(shè)定某一信號的最低強度值，可將不需要的脈沖信號去除，這一設(shè)定值稱為閾值。,屏蔽噪音信號和碎片信號,47,門（Gate）,分析/分選感興趣的細胞群,48,對照,同型對照：為沒有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白，通常是未進行免疫小鼠血清的純化IgG1或IgG2，用于檢測和消除（一抗）非特異性結(jié)合到組織細胞而產(chǎn)生的背景染色