1、新診斷技術及其在NTP中的應用,江蘇省結核病參比實驗室,NTP中現行實驗室技術,涂片：萋尼染色顯微鏡檢 培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基：簡單法、離心法 藥敏：固體培養(yǎng)基：絕對濃度法、比例法 菌種鑒定：鑒別培養(yǎng)基生化試驗 傳統(tǒng)實驗室技術不能適應不斷深入的結核病防治工作的需要,實驗室新診斷技術總覽,細菌學檢測方法 發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED） 液體培養(yǎng) 分子生物學檢測方法 Genexpert HAIN Genechip 免疫學檢測方法 ELISOPT 42:2321-2325 2 Mean of 14 studies in MGIT960 = 10.7% (2.0-30.0) = acceptable ran

2、ge,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml,MGIT 7 ml + S,MGIT 7 ml + I,MGIT 7 ml + R,MGIT 7 ml + E,GC,S,I,R,E,0,8 ml BACTEC MGIT SIRE 補充劑,每種藥物0,1 ml,轉移 0,5 ml 陽性 MGIT 培養(yǎng)物,0,1 ml 陽性 MGIT 培養(yǎng)物,9,9 ml 蒸餾水,轉移 0,5 ml,插入BACTEC MGIT 960,BACTEC MGIT 960 TB 藥敏試驗 S.I.R.E.,LED顯微鏡,發(fā)光二級管 (LED)

3、 技術 提供價廉、穩(wěn)定的光源 壽命 150,000 h 反復開關不影響壽命 不釋放有毒氣體 不需要暗室 操作人員工作負荷減輕,快速藥敏-商業(yè)化線性探針檢測（LPAs）,GenoType MTBDRplus, HAIN 檢測結核分枝桿菌復合群以及利福平、異煙肼耐藥相關的突變 檢測XDR的試劑盒也已經發(fā)布 INNO-Lipa Rif TB 檢測結核分枝桿菌復合群以及于利福平耐藥相關的突變 大多數利福平耐藥的菌株同時也耐異煙肼 WHO 鼓勵使用的工具 可使用涂陽痰標本和培養(yǎng)物進行操作 快速、簡便易用，僅需基本PCR技術 然而，價格比較昂貴，且不能檢測造成耐藥突變的熱點區(qū)域外的突變,11,MTBDRp

4、lus 操作流程,DNA提取 用NALC/NaOH 處理痰標本,2) PCR擴增,3) 雜交 擴增產物和 固化在 膜上的特異性探針雜交,4) 結果判讀,rpoB 野生型探針: WT1 - WT8 rpoB 突變探針: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L 野生型缺失 野生型突變,MTBDRplus rpoB,katG 基因突變,MTBDRplus katG,MTBDRplus inhA,inhA 基因突變,MTBDRplus 反應條帶(示范),南非的經驗：,Genotype MTBDR plus assay: 直接從涂片陽性標本中檢測rpob基因突變 (耐利福平

5、), katG 基因 (高濃度異煙肼耐藥), inhA 基因(低濃度異煙肼耐藥) 靈敏度、特異度，陽性預測值、陰性預測值 耐利福平 98.9, 99.4, 97.9, 和99.7 耐異煙肼 94.2, 99.7, 99.1, 和 97.9 耐MDR-TB 98.8, 100, 100, 和 99.7,Barnard M, et al. Am J Respir Crit Care Med 2008;177:787-92,結核耐藥檢測基因芯片,激光共焦掃描儀,軟件判讀,結核耐藥檢測芯片獲北京市自主創(chuàng)新產品證書,樣品制備儀,雜交儀,通 量：兩個一線抗結核藥 速 度： 6 小時（比傳統(tǒng)藥敏試驗法快 5

6、0-100 倍） 靈敏度：103 CFU/反應 特異性：對照設計嚴謹；自動判讀,基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰樣本中結核桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）。,International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）,18,獲國家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認證,Xpert MTB/RIF,檢測結核分枝桿菌 檢測利福平耐藥 直接標本檢測 100分鐘可獲得結果,工作流程 痰 簡單，僅需1個步驟的準備工作 獲得結果的時間 16 樣本 / 天 / 模塊 不需要生物安全規(guī) 綜合

7、控制 性能 對 MTB特異 敏感性與培養(yǎng)相似 通過rpoB 基因檢測利福平耐藥 產品和系統(tǒng)設計 GeneXpert 系統(tǒng)的檢測模塊 測試模塊的擴大和交換 對非分枝桿菌實驗室人員僅需要最多1天的培訓,GeneXpert,樣本準備、擴增、檢測自動化,MTB / 利福平耐藥性檢測,痰標本可以直接放入模塊中，而無需與任何試劑進行混合處理,Xpert MTB/RIF,單中心評估研究（初步結果）,不同研究設計和研究人群，肺結核和肺外結核標本 檢測結核 匯總的未經校正的敏感性 92% 匯總的未經校正的特異性 98% 檢測利福平耐藥 匯總的未經校正的敏感性 98% 匯總的未經校正的特異性 99%,操作方面,廢

8、棄物管理 如痰標本容器 儲存和供應 反應盒龐大, 2 - 28C, 有效期12個月 電力供應 UPS (400 VA) 或電池組 培訓 需求不高 (使用計算機、預防污染) 生物安全 與涂片鏡檢相同 每年校正 模塊更換 安全 防盜 (計算機),世界衛(wèi)生組織 快速開展Xpert MTB/RIF診斷試驗 技術和實施方面的考慮 2011年3月,WHO對Xpert MTB/RIF的建議摘要：,高度推薦用于懷疑MDR-TB以及合并HIV感染的結核病病人的初診診斷 對于MDRTB、HIV不嚴重的地區(qū)，可以在涂片之后考慮使用Xpert MTB/RIF，特別是用于診斷涂陰病人（取決于費用） 肺外標本的有關證據尚

9、有限 增加檢測次數可能增加敏感性，但需考慮費用增加 適用于兒童 不能替代傳統(tǒng)涂片、培養(yǎng)、藥敏試驗,步驟 1: 特異抗原激發(fā)淋巴細胞,IFN- 釋放,陰性對照,ESAT-6 或 CFP-10,孵育,孵育,顯影,步驟 2: 用ELISA 檢測 IFN- ,Y Y Y,Y,Y,Y,Y Y Y,洗滌,Y Y Y,Y,Y,Y,洗滌,Y Y Y,QuantiFERON TB Gold實驗,T-SPOT TB (ELISPOT)技術,單核細胞分離,TB抗原刺激，IFN- 釋放,一抗捕獲IFN-,與標記的二抗結合,酶作用標記物顯色,每一斑點代表釋放IFN-的一個細胞,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y

10、,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,IFN-,抗原,小 結,NTP中如何應用 給誰用？哪里做？怎么用？,國家結核病參比實驗室推薦建議,液體培養(yǎng)用于: 結核病可疑癥狀者檢查, 可以作為結核?。退帲┑脑\斷依據和結核病患者治療效果判斷, 液體培養(yǎng)可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng),推薦理由: 液體培養(yǎng)在已經在我國注冊； 國內外研究顯示其敏感性和TAT優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)； 數據顯示在我國具有可行性,符合成本效果；,推薦使用層級: 區(qū)縣、地市和省級（醫(yī)療機構和疾病預防機構）,國家結核病參比實驗室推薦建議,GenXpert 即將可以用于: 結核病可疑癥狀者檢查, 可以作為結核病的輔助診斷方法和結核病患者治療效

11、果判斷, 它有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)和利福平的藥敏試驗（可疑耐藥結核病患者）,推薦理由: 即將在我國獲得注冊證書； 國內外研究顯示其敏感性和特異性，陽性結果報告時間優(yōu)于傳統(tǒng)方法； WHO 在全球推薦 數據顯示在我國具有可行性,符合成本效果；,可能使用層級: 區(qū)縣（？）、地市和省級（醫(yī)療機構和疾病預防機構）,國家結核病參比實驗室推薦建議,LPA可以用于: 可疑耐藥結核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗,推薦理由: 在我國獲得注冊證書； 國內外研究顯示其敏感性和特異性（TAT)較好； WHO 在全球推薦 數據顯示在我國具有可行性,符合成本效果；,可能使用層級: 地市和省級（醫(yī)療機構和疾病預

12、防機構）,國家結核病參比實驗室推薦建議,基因芯片可以用于: 可疑耐藥結核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗,推薦理由: 在我國獲得注冊證書； 國內研究顯示其敏感性和特異性和(TAT)較好； 民族品牌 數據顯示在我國具有可行性,符合成本效果；,可能使用層級: 地市和省級（醫(yī)療機構和疾病預防機構）,國家結核病參比實驗室推薦建議, 干擾素釋放試驗可以用于: 結核菌潛伏感染篩查,兒童和老年人以及免疫力低下者結核病的輔助診斷（參考）,推薦理由: 在我國獲得注冊證書，國家對一些特殊診斷試劑的規(guī)定； 國內外研究顯示其敏感性和（特異性）較好； 數據顯示在我國具有可行性,可能使用層級: 縣區(qū)、地市和省級（醫(yī)療機構和疾病預防機構）,我國新診斷技術應用設想,根據國家結核病防治規(guī)劃的需要，按照不