1、3.5 DNA重組,一、DNA重組的定義和意義 二、同源重組 三、位點特異重組 四、轉(zhuǎn)座重組,一、DNA重組的定義和意義,DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，稱為遺傳重組（genetic recombination），也叫DNA重組。DNA重組廣泛存在于各類生物。真核生物基因組的遺傳重組多發(fā)生在減數(shù)分裂時同源染色體之間的交換（Crossover）。細(xì)菌及噬菌體的基因組為單倍體，來自不同親代的兩組DNA之間可通過多種形式進(jìn)行遺傳重組。,DNA重組對生物進(jìn)化起著關(guān)鍵的作用。生物進(jìn)化是生物隨時間發(fā)生變化和多樣化的過程。生物進(jìn)化以不斷產(chǎn)生的可遺傳變異為基礎(chǔ)。然而，突變的機(jī)率很低，而且多數(shù)突變是

2、有害的。如果生物只有突變沒有重組，在積累優(yōu)勢突變的同時，不可避免地積累許多難以擺脫的不利突變，有利突變將和不利突變一起被淘汰，新的優(yōu)良基因就可不能出現(xiàn)。重組的意義在于，它能夠迅速增加群體的遺傳多樣性（diversity），通過優(yōu)化組合積累有利的突變。,遺傳重組的意義,遺傳重組的意義,遺傳重組系統(tǒng)的功能隨它們的機(jī)制而變化，包括在特異DNA修復(fù)系統(tǒng)中的作用，在DNA復(fù)制中的特異活性，某些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，在真核細(xì)胞分裂期間促進(jìn)染色體分離，維持遺傳多樣性，和在胚胎發(fā)育期間實現(xiàn)程序性遺傳重排。,DNA重組的類型,DNA重組主要包括三種類型： 同源重組（homologous recombination）

3、位點特異重組（site-specific recombination） 轉(zhuǎn)座重組（transpositional recombination）,二、同源重組,同源重組也叫一般性重組（general recombination ），它包括任何兩個DNA分子（或同一個分子的兩個片段）之間的遺傳交換。發(fā)生交換的兩個分子或同一分子的兩個片段之間有一段近乎相同的序列（同源區(qū)），不論這個序列的具體堿基序列是什么，只要這兩段DNA序列相似就可以發(fā)生。這兩個同源區(qū)通過配對、鏈斷裂和再連接，產(chǎn)生片段交換。,減數(shù)分裂中的同源重組,在減數(shù)分裂前期，參與聯(lián)會的同源染色體實際上已復(fù)制成兩條染色單體，從而出現(xiàn)由4條染色單

4、體構(gòu)成的四聯(lián)體。在四聯(lián)體的某些位置，非姊妹染色單體之間可以發(fā)生交換。,細(xì)菌中同源重組的意義,在細(xì)菌中，同源重組主要發(fā)生在DNA修復(fù)過程，本書中稱為重組DNA修復(fù)。它通常是指對DNA損傷位點進(jìn)行復(fù)制叉重建。在接合（交配）期間，當(dāng)染色體DNA從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞時，也能夠發(fā)生同源重組。接合期間的重組雖然很少在野生型細(xì)菌中發(fā)生，但卻產(chǎn)生了遺傳多樣性。,細(xì)菌中同源重組的意義,細(xì)菌可以通過多種途徑進(jìn)行細(xì)胞間基因轉(zhuǎn)移，并通過基因重組以適應(yīng)隨時改變的環(huán)境。細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移主要有四種機(jī)制：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞融合。 F+ 細(xì)胞的 F 因子通過接合可將供體大腸桿菌的染色體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中（轉(zhuǎn)移的也可能是部分

5、染色體），供體染色體DNA進(jìn)入受體細(xì)胞后，可與受體染色體發(fā)生同源重組，增加受體細(xì)胞的遺傳多樣性。,Holliday模型,Robin Holliday于1964年提出一個解釋同源重組的模型，在這個模型中，兩個同源染色體DNA排列整齊；一個DNA的一條鏈斷裂并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成連接分子，稱為Holliday中間體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA；holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體。,Holliday模型,Holliday模型的缺點,Holliday模型能夠較好地解釋同源重組現(xiàn)象。但該模型認(rèn)為進(jìn)行重組的兩個DNA分子在開始時需要的對應(yīng)鏈的相同位置上發(fā)生斷裂，這是很難設(shè)

6、想的。現(xiàn)在認(rèn)為，同源分子中的一個分子需要雙鏈斷裂才能啟動與另一個分子之間發(fā)生重組。同源重組是減數(shù)分裂時同源染色體聯(lián)會的原因，而不是結(jié)果。,DNA雙鏈斷裂啟動同源重組,這個模型有四個關(guān)鍵特征。首先，同源染色體對齊。第二，一個DNA分子的雙鏈斷裂被核酸外切酶擴(kuò)大，在斷裂端產(chǎn)生3突出的單鏈（步驟1）。第三，暴露的3末端侵入完整的雙鏈DNA，然后分支移動（branch migration）和復(fù)制產(chǎn)生一對交換結(jié)構(gòu)，稱為Holliday連結(jié)體（Holliday junctions）（步驟2到4）。第四，兩個交換斷裂產(chǎn)生兩個完整的重組產(chǎn)物（步驟5）。,DNA雙鏈斷裂啟動同源重組,DNA雙鏈斷裂啟動同源重組,

7、同源重組時的分支移動,Holliday中間體的電鏡照片,A Holliday intermediate formed between two bacterial plasmids in vivo, as seen with the electron microscope. The intermediates are named for Robin Holliday, who first proposed their existence in 1964.,重組需要多種酶及其它蛋白質(zhì)的作用,從原核生物和真核生物中已經(jīng)分離出了促進(jìn)同源重組各步驟的酶。在大腸桿菌中，recB、recC和recD基因編碼

8、RecBCD酶，它具有解旋酶和核酸酶兩種活性。RecA蛋白促進(jìn)同源重組所有的重要步驟：兩個DNA配對，形成Holliday中間體，分支移動。RuvA和RuvB蛋白（修復(fù)UV損傷）形成一個復(fù)合物結(jié)合到Holliday中間體上，取代RecA蛋白，促進(jìn)以比RecA更高的速度分支移動。特異裂解Holliday中間體的核酸酶（常稱為解離酶）已經(jīng)從細(xì)菌和酵母中分離出來了。RuvC蛋白是大腸桿菌中至少兩種這樣的核酸酶中的一種。,RecBCD酶的作用,RecBCD酶結(jié)合到線性DNA的斷裂端，沿著雙螺旋移動，解開并降解DNA，這是與ATP水解相偶聯(lián)的反應(yīng)。當(dāng)它和一個稱為chi的序列（GCTGGTGG）相互作用時

9、，酶活性被改變。從這個點，具有3末端的鏈的降解逐漸減緩，但具有5末端的鏈的降解加速。這個過程產(chǎn)生了一段具有3末端的單鏈突出。,RecBCD酶的作用,Chi位點與重組頻率的關(guān)系,在大腸桿菌基因組中散布的1009個chi序列使得chi位點1000bp范圍內(nèi)重組的頻率增加了約5-10倍。隨著離chi位點距離的增加，重組頻率下降。在其它幾種生物中也鑒別出了增加重組頻率的序列。,RecA蛋白的作用,RecA結(jié)合到缺口處的DNA單鏈部分上，然后裝配成的纖絲迅速覆蓋到鄰近的雙鏈部分。RecF、RecO和RecR蛋白調(diào)節(jié)RecA纖絲的裝配和拆卸。 表示RecA纖絲重組活性的一個有用模型是體外DNA鏈交換反應(yīng)。

10、首先RecA結(jié)合到DNA的一條單鏈上，裝配成核蛋白纖絲。RecA纖絲與同源雙鏈DNA結(jié)合并對齊，然后在兩個DNA分子之間發(fā)生鏈交換，產(chǎn)生雜合DNA。交換以6bp/s的速率進(jìn)行，相對于RecA纖絲中的單鏈DNA以53的方向前進(jìn)。這個反應(yīng)能夠涉及三或四條鏈。在涉及四條鏈時，就會形成Holliday中間體。,RecA蛋白與單鏈DNA組成核蛋白纖絲,右手螺旋每一圈含6個RecA蛋白，紅色表示其中一個RecA蛋白單體。,RecA介導(dǎo)的DNA鏈交換模型,體外RecA促進(jìn)的鏈交換反應(yīng),體外RecA促進(jìn)的鏈交換反應(yīng),同源重組中其它酶的作用,一旦Holliday中間體形成，還需要一批宿主的酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶、Ruv

11、AB分支轉(zhuǎn)移蛋白、解離酶、其它核酸酶、DNA聚合酶和及DNA連接酶）來完成重組。大腸桿菌的RuvC蛋白（Mr20,000）裂解Holliday中間體，產(chǎn)生全長的、不分支的染色體產(chǎn)物。,同源重組對同源序列的要求,DNA同源重組是一個十分精確的過程，哪怕只有一個核苷酸的差錯都會導(dǎo)致基因失活。同源重組的分子基礎(chǔ)是鏈間的堿基配對，通過堿基配對才能找到正確的位置，進(jìn)行鏈的交換。實驗表明，兩DNA分子必須具有75bp以上的同源區(qū)才能發(fā)生同源重組，同源區(qū)小于此長度將顯著降低重組率。同源區(qū)并不要求完全相同，少量的序列差異也可以進(jìn)行同源重組。,三、位點特異重組,位點特異重組事實上發(fā)生在每一個細(xì)胞里，在不同的物種

12、中作用差別非常大。作用包括調(diào)節(jié)某些基因表達(dá)和在胚胎發(fā)育中或在某些病毒和質(zhì)粒的復(fù)制循環(huán)中促進(jìn)程序性DNA重排。每一個位點特異重組系統(tǒng)由重組酶和一段短的、特異的DNA序列組成，這個特異序列是重組酶的作用位點（重組位點）。,位點特異重組的機(jī)制,重組酶識別和結(jié)合到兩個不同DNA分子或同一個DNA分子的兩個重組位點上。在每一個位點處一條DNA鏈在位點內(nèi)的特異點斷裂，重組酶在斷裂位點通過磷酸酪氨酸（或磷酸絲氨酸）共價連接到DNA上。暫時的蛋白質(zhì)DNA連接保護(hù)了DNA斷裂的磷酸二酯鍵，使得在后續(xù)的步驟中不需要消耗高能輔因子如ATP。斷裂的DNA鏈被重新連接到新的伴侶上，形成Holliday中間體，蛋白質(zhì)DN

13、A連接轉(zhuǎn)變成新的磷酸二酯鍵。為了完成反應(yīng)，過程必須在兩個重組位點中的第二個點重復(fù)。,位點特異重組的機(jī)制,位點特異重組點的重組酶四聚體及與DNA結(jié)合的模型,另一種位點特異重組機(jī)制,在某些系統(tǒng)中，每一個重組位點的兩條鏈被同時切開，然后重新連接到新的伴侶上，而不形成Holliday中間體。 交換總是相互和精確的，反應(yīng)完成后重新產(chǎn)生重組位點。重組酶既是位點特異的內(nèi)切核酸酶又是連接酶。,位點特異重組的結(jié)果,噬菌體整合到大腸桿菌染色體上,體外研究的第一個位點特異重組系統(tǒng)是噬菌體編碼的。當(dāng)噬菌體DNA進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，一系列復(fù)雜的調(diào)節(jié)事件使得DNA進(jìn)入兩條途徑之一。DNA要么復(fù)制，產(chǎn)生更多的噬菌體（進(jìn)入裂解

14、途徑）；要么整合到宿主染色體上，隨著染色體復(fù)制而傳給子細(xì)胞（進(jìn)入溶源化途徑）。整合由噬菌體編碼的重組酶（整合酶）催化，它作用于噬菌體和細(xì)菌DNA的重組位點，這些位點叫附著位點，分別是attP和attB。,噬菌體整合到大腸桿菌染色體的特異位點處,位點特異重組在DNA復(fù)制中的作用,環(huán)狀的細(xì)菌染色體的重組DNA修復(fù)，有時產(chǎn)生有害的副產(chǎn)物。由核酸酶如RuvC在復(fù)制叉處裂解Holliday中間體，從而完成復(fù)制，可以產(chǎn)生兩種產(chǎn)物：兩個單體染色體，或連接的雙體染色體。在共價連接染色體的情況下，細(xì)胞不能分裂成兩個子細(xì)胞，正在分裂的細(xì)胞成為“棒狀”。大腸桿菌中一種特殊的位點特異重組系統(tǒng)，XerCD系統(tǒng)，可以將雙

15、體染色體轉(zhuǎn)變成單體染色體，細(xì)胞分裂得以進(jìn)行。反應(yīng)是位點特異的刪除反應(yīng)。,位點特異重組在DNA復(fù)制中的作用,Fork undergoing recombinational DNA repair,Tremination of replication,Resolution to monomers by XerCD system,2,Dimeric genome,細(xì)菌位點特異重組對基因表達(dá)的調(diào)控,鼠傷寒沙門氏桿菌由鞭毛蛋白決定的H抗原有兩種，分別為H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白。從單菌落的沙門氏菌中經(jīng)常能出現(xiàn)少數(shù)呈另一H抗原的細(xì)菌細(xì)胞，這種現(xiàn)象稱為鞭毛相轉(zhuǎn)變。遺傳分析表明，這種抗原相轉(zhuǎn)變是由一段995bp的DNA（H片段）發(fā)生倒位導(dǎo)致的。 H片段的兩端為14bp的特異重組位點hi