1、研究背景,HBV慢性感染 主要原因,HBV特異細胞免疫 功能的低下,T細胞,樹突狀細胞（DC）,慢性乙型肝炎患者 DC成熟、功能 異常,研究背景（1）,特異性CTL 數(shù)量少 低反應(yīng),HBV慢性感染 主要原因,HBV特異細胞免疫 功能的低下,T細胞,樹突狀細胞（DC）,慢性乙型肝炎患者 DC成熟、功能 異常,促進DC成熟、恢復(fù)DC 的功能,增強DC激活特異性 抗病毒免疫反應(yīng),打破免疫耐受 徹底清除病毒,研究背景（1）,特異性CTL 數(shù)量少 低反應(yīng),獲得高頻數(shù)、功能強 HBV特異性的CTL,促進DC成熟，增強DC功能,CpG,CD40L,Ad-IL-12 轉(zhuǎn)染,Poly（I：C）,關(guān)于恢復(fù)DC功能

2、的研究,研究背景（2）,研究目的,本研究通過在體外進行慢性乙型肝炎患者單核細胞的DC方向轉(zhuǎn)化，并輔以聚肌胞Poly(I:C)刺激，增強DC的成熟和功能。 將患者DC經(jīng)HBV core18-27肽負載后，刺激病人自身的T淋巴細胞。并用Elispot法及本研究室構(gòu)建的HLA-A2肽四聚體復(fù)合物檢測病毒特異性T淋巴細胞的數(shù)量和功能。,研究對象和方法,研究對象,22例HLA-A2+慢性乙型肝炎患者。 HBeAg+患者16例、 HBeAb+患者6例。HBV DNA 均104 copy/ml。 排除HCV、HAV、HDV、HEV感染。近半年沒有接受過抗病毒治療。,研究方法,HLA-A2型別鑒定 DC的體外

3、培養(yǎng)擴增及鑒定 以樹突狀細胞為抗原遞呈細胞體外誘導(dǎo)病毒抗原特異性T細胞 Elispot檢測分泌IFN-的T細胞頻數(shù) MHC-肽四聚體檢測 HBVcore18-27 肽特異性CD8 + T 細胞,HLA-A*02型別鑒定,外周血淋巴細胞標(biāo)記鼠抗人HLA-A02單抗； 流式細胞儀檢測； 每份標(biāo)本均設(shè)自身陰性對照。,樹突狀細胞的體外培養(yǎng)擴增及鑒定,分離病人PBMC； GM-CSF、IL-4 刺激下DC培養(yǎng)轉(zhuǎn)化； Poly(I:C)刺激； 通過流式細胞儀檢測DC的HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14等表面分子表達，進行功能及成熟度的鑒定。,以DC為抗原遞呈細胞體外誘導(dǎo)HBV抗原特異性T

4、細胞,培養(yǎng)成熟DC負載HBV 核心肽（HBV core18-27 FLPSDFFPSV）； DC與自體T細胞共培養(yǎng)48-72h； 單純IL-2維持未經(jīng)自身樹突狀細胞刺激T細胞組為對照。,Elispot檢測分泌IFN-的T細胞頻數(shù),封閉 種板 孵育：37，5% CO2 孵育15-20 h； 顯色 計數(shù)：CTL IMMUNOSPOT分析儀計數(shù)，取兩復(fù)孔的平均值,MHC-肽四聚體檢測 HBVcore18-27 肽特異性CD8 + T 細胞,PE-HLA-A0201/HBVcore 18-27 tetramer 和FITC-鼠抗人CD8標(biāo)記； 流式細胞儀檢測； 慢性乙型肝炎患者，采用HLA-0201/

5、HCV 四聚體標(biāo)記作為陰性對照；,統(tǒng)計學(xué)處理,實驗數(shù)據(jù)以xSD表示。用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用配伍組方差分析。,結(jié) 果,DC的擴增、表型鑒定及Poly (I:C)對其表面分子表達的影響,慢性乙型肝炎病人DC經(jīng)Poly (I:C)作用前后表面分子表達的比較 *表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）,經(jīng)Poly(I:C)刺激后： CD80、CD83表達明顯上調(diào)。 CD14的表達明顯下降 。,Poly(I:C)對DC表面分子表達的影響,Elispot檢測HBV特異性的分泌IFN- 的CTL細胞頻數(shù)的比較,1 2 3 1.慢乙肝病人體外經(jīng)IL-2維持生長的T細胞； 2.經(jīng)自體DC刺激后

6、的T細胞； 3.DC經(jīng)Poly（I:C）作用后刺激的T細胞,樹突狀細胞激活的分泌IFN-的CTL細胞的頻數(shù)分布圖,T：慢性乙型肝炎患者體外經(jīng)IL-2維持生長的T細胞； DC-T：經(jīng)樹突狀細胞刺激后的T細胞； PDC-T：樹突狀細胞經(jīng)Poly（I:C）作用后刺激的T細 （“”表示均數(shù)）,Elispot檢測結(jié)果說明,病人T細胞在經(jīng)自體樹突狀細胞刺激后與未刺激前相比，分泌IFN- 的CTL細胞頻數(shù)均值由16上升為46，約為2.9倍； 發(fā)現(xiàn)經(jīng)Poly（I:C）作用后的樹突狀細胞所活化的特異性分泌IFN-的T細胞頻數(shù)明顯升高，均值為98，和未經(jīng)樹突狀細胞刺激組和樹突狀細胞刺激組相較，分別升高6.1和2.

7、1倍。,Tetramer 流式細胞技術(shù)檢測 HBVcore18-27 特異性CD8 + T 細胞結(jié)果,PE-HLA-A0201/HBVcore 18-27 tetramer 和FITC-鼠抗人CD8標(biāo)記T細胞，行流式檢測。 以淋巴細胞設(shè)門，收集門內(nèi)細胞50,000個, 右上象限細胞數(shù)/右上及右下象限細胞數(shù)之和即為抗原特異性CTL占CD8+細胞數(shù)比例（圖中右上象限的百分比值）。,1PE-羊抗鼠IgG/FITC-鼠抗人CD8標(biāo)記的T細胞； 2. IL-2維持的自身T細胞； 3.與樹突狀細胞作用的T細胞； 4.與poly（IC）刺激后的樹突狀細胞作用的T細胞,圖3. tetramer檢測特異CD8

8、+ T 細胞的頻數(shù)分布圖,Control：非相關(guān)肽四聚體標(biāo)記的T細胞； T：IL-2維持的自身T細胞； DC-T：與樹突狀細胞作用的T細胞； PDC-T：與poly（IC）刺激后的樹突狀細胞作用的T細胞。,Tetramer 結(jié)果說明,患者T細胞在經(jīng)自體樹突狀細胞刺激后與未刺激前相比， HBV core18-27 肽特異的CTL頻數(shù)均值由0.77 %上升至1.92%，提高約2.5倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P 0.001）。 經(jīng)Poly（I:C）刺激的樹突狀細胞活化后，HBVcore18-27 表位特異性CTL的頻數(shù)均值上升為3.49 %，分別為前2組的4.5和1.8倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均

9、小于0.001）。,討 論,討論（1）,樹突狀細胞能激活幼稚T細胞，調(diào)節(jié)T、B淋巴細胞的功能；在病毒抗原攝取、遞呈及特異性激活抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，是抗感染免疫的中心環(huán)節(jié)。 HBV急性感染時：多克隆、高反應(yīng)性的病毒特異性CTL可迅速、徹底清除病毒； HBV慢性感染時：單一克隆、弱反應(yīng)性的病毒特異性CTL。,討論（2）,聚肌胞Poly(I:C)是一種型和型干擾素的強誘生劑。 Poly（I:C）能夠有效地誘導(dǎo)體外單核細胞轉(zhuǎn)化的樹突狀細胞成熟，并維持樹突狀細胞的成熟狀態(tài) 。 CD83：DC成熟；行使功能 CD83表達 DC成熟及功能改善 CD14：單核細胞的特異性分子標(biāo)記 CD14表達 DC分化程度改善,討論（3）,MHC-肽四聚體染色法檢測HBVcore18-27 特異性CTL的數(shù)量： 高特異性、敏感性 對特異性CTL進行定性、定量分析 用于感染、腫瘤、自身免疫性疾病等的細胞免疫學(xué)研究和治療效果監(jiān)測。 Elispot 檢測活化的分泌IFN-的有功能的病毒特異性T細胞 兩種技術(shù)結(jié)合 能夠更準(zhǔn)確、客觀地評價體外轉(zhuǎn)化的樹突狀細胞活化特異性 T淋巴細胞的能力。,結(jié) 論,慢性乙型肝炎患者T細胞在體外經(jīng)自