1、.,.,蛋白質分離與純化技術,蛋白質（protein）是生命的物質基礎，沒有蛋白質就沒有生命。因此，它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質。機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。 蛋白質分離純化是用生物工程下游技術從混合物當中分離純化出所需要的目的蛋白質的方法。由于深入研究蛋白質的結構與功能需要用到高純度的蛋白質，因此蛋白質分離與純化技術是生物產業(yè)中的核心技術。,.,一般程序,預處理 蛋白質的抽提 蛋白質粗分級 蛋白質純化,.,預處理,分離提純某一蛋白質，首先要求把蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原有的天然狀態(tài)，不喪失生物活性。 常用的破碎方法

2、有： 機械方法：如均漿噴射、研磨或超聲波 化學法：如去污劑、有機溶劑處理 酶學方法：如溶菌酶處理,.,蛋白質的抽提,一般的蛋白質通常選擇適當?shù)木彌_溶液把蛋白質提取出來，再用離心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。抽提所用緩沖溶液的PH值、離子強度、組成成分等應根據(jù)目的蛋白質的性質而定。,.,蛋白質粗分級,采用分級鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法將目標蛋白質與其他蛋白質分離開來。,.,蛋白質純化,在蛋白質純化過程中，從細胞破碎一步開始蛋白質就脫離了天然的環(huán)境，受到各種不同試劑的干擾，其結構和功能會受到不同程度的可逆或不可逆的損害。因此，在蛋白質純化的各步驟都要小心地控制所采用的提純條件

3、，以避免蛋白質變性。 在提純蛋白質過程中需要在每一步檢測蛋白質（酶）的存在及提純的情況，即建立蛋白質定量檢測方法。,.,蛋白質純化的常用方法,采用分離和提純蛋白質的各種方法，主要是利用蛋白質之間的各種特性差異： 根據(jù)分子大小不同的分離方法 利用溶解度差別的分離方法 根據(jù)蛋白質的吸附性質分離 根據(jù)對配基的生物學特異性 根據(jù)蛋白質分離,.,根據(jù)分子大小不同的分離方法,透析和超濾：利用蛋白質分子不能通過半透膜的性質，使蛋白質和其他小分子物質如無機鹽、單糖、水等分開。 離心分離：蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開，經常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質的方法。 凝膠過濾層析：利用凝

4、膠介質交聯(lián)度或者孔度（網孔大?。﹣頉Q定凝膠的分級范圍。,.,利用溶解度差別的分離方法,等電點沉淀和PH值控制：等電點時蛋白質的凈電荷為零，溶解度最低。相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節(jié)溶液的pH值來分離純化蛋白質。 蛋白質的鹽溶和鹽析：中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現(xiàn)象,其中,增加蛋白質溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶,反之為鹽析。 有機溶劑分級法：與水互溶的有機溶劑（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低。而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉淀的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。,.,根據(jù)蛋白質的吸附性質分離,某些物質，如極

5、性的硅膠和氧化鋁以及非極性的活性炭等，具有吸附能力，能夠以不同強弱的吸附力吸附蛋白質。 吸附層析法就是利用這種吸附力的強弱不同而達到分離的目的。,.,根據(jù)對配體的特異親和力進行純化,配基是指能被生物大分子識別并與之結合的原子、原子團、分子。如酶的作用底物、輔酶及其結構類似物。 親和層析，這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質分子對于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識別和結合能力。 選擇與待純化蛋白質具有特殊識別和結合作用的配基，然后應用化學方法將該配基與載體共價連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱中，當含有待純化的蛋白質溶液通過層析柱時，該蛋白質即與配基發(fā)生特異性結合而被吸附

6、在層析柱上，而其它蛋白質則流出柱外。被特異性結合在層析柱上的蛋白質，可以用適當?shù)呐潴w洗脫液洗脫。,.,根據(jù)蛋白質帶電狀態(tài)分離,離子交換層析IEC是根據(jù)蛋白質的兩性解離性質、在溶液中所帶電荷不同進行分離的。 離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。當?shù)鞍踪|處于不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。,.,小結,蛋白質在組織或細胞中一般都是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的