1、實驗三 補體溶血實驗,補體溶血實驗,補體：一組存在于人和脊椎動物血清中及組織液中具有酶樣活性，不耐熱和功能上連續(xù)反應(yīng)的糖蛋白，是抗體發(fā)揮溶細胞作用的必要補充條件，在正常情況下，血清中的補體大多以無活性酶前體形式存在。,物理性質(zhì)：不穩(wěn)定，易受各種理化因素的影響，加熱，紫外線照射，機械震蕩，酸堿和酒精等因素均可破壞補體。 滅活：56加熱30min即可滅活,補體系統(tǒng)的生物學(xué)功能,（1）溶菌和溶細胞作用：補體系統(tǒng)激活后，在靶細胞表面形成MAC，從而導(dǎo)致靶細胞溶解。 （2）調(diào)理作用：補體激活過程中產(chǎn)生的C3b、C4b、iC3b都是重要的調(diào)理素，可結(jié)合中性粒細胞或巨噬細胞表面相應(yīng)受體，因此，在微生物細胞表

2、面發(fā)生的補體激活，可促進微生物與吞噬細胞的結(jié)合，并被吞噬及殺傷。,（3）引起炎癥反應(yīng)：在補體活化過程中產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)C3a、C4a、C5a。它們又稱為過敏毒素，與相應(yīng)細胞表面的受體結(jié)合，激發(fā)細胞脫顆粒，釋放組胺之類的血管活性物質(zhì)，從而增強血管的通透性并刺激內(nèi)臟平滑肌收縮。C5a還是一種有效的中性粒細胞趨化因子。,（4）清除免疫復(fù)合物：機制為：補體與Ig的結(jié)合在空間上干擾Fc段之間的作用，抑制新的IC形成或使已形成的IC解離。循環(huán)IC可激活補體，產(chǎn)生的C3b與抗體共價結(jié)合。IC借助C3b與表達CR1和CR3的細胞結(jié)合而被肝細胞清除。,（5）免疫調(diào)節(jié)作用：C3可參與捕捉固定抗原，使抗原易被APC處

3、理與遞呈。補體可與免疫細胞相互作用，調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化。參與調(diào)節(jié)多種免疫細胞的功能。,補體激活的途徑：,經(jīng)典途徑 旁路途徑 MBL途徑 相同點：三條途徑有共同的末端通路，即形成膜攻擊復(fù)合物溶解細胞。,1、補體經(jīng)典途徑(classical pathway)：是指以抗原抗體復(fù)合物為主要刺激物，使補體固有成分以C1、C4、C2、C3、C5C9順序發(fā)生酶促連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)和最終發(fā)生細胞溶解作用的補體活化途徑。,2、替代途徑（旁路途徑）:是指不經(jīng)C1、C4、C2活化，而是在B因子、D因子和P因子參與下，直接由C3b與激活物結(jié)合啟動補體酶促連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)和最終發(fā)生細胞溶解作

4、用的補體活化途徑。在感染早期可為機體提供有效的防御機制。其激活物是病原微生物等提供接觸表面,3、MBL途徑：在感染早期，體內(nèi)分泌甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)和C反應(yīng)蛋白。MBL與細菌表面的甘露糖殘基結(jié)合，然后與絲氨酸蛋白酶結(jié)合形成MASP（MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶），MASP繼而水解C4和C2啟動后序的酶促連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)和最終發(fā)生細胞溶解作用的補體活化途徑。激活物（或激活劑）是炎癥期產(chǎn)生的蛋白和病原體。,三條途徑的區(qū)別見下表,補體的來源、采集,實驗室常用豚鼠、兔的新鮮血清作為補體的來源。 補體的采集：一般選用3-5只健康未妊娠的豚鼠或兔子，以無菌操作采集血液，采集好的血液置4冰

5、箱過夜，次日離心分離血清即可分離到補體。,溶血素（抗綿羊紅細胞抗體）：是以SRBC作為抗原免疫家兔所得到的兔抗血清，無需進一步提純，但試驗前應(yīng)先56加熱30min或者60 3min滅活補體。 溶血反應(yīng)：由于抗原（紅血球）和抗體（溶血素）進行特異性的結(jié)合，在電解質(zhì)存在時能發(fā)生凝集，若再有補體參與，紅血球則被溶解。,實驗?zāi)康?掌握補體測定方法 加深了解補體的作用和激活條件,材料與試劑,試劑 1.抗原：2%綿羊紅細胞 2.抗體：溶血素 3.補體：實驗室常以健康豚鼠血清作為補體 材料:小試管，生理鹽水，水浴箱,實驗方法,取試管4支，按下表加入各物,實驗方法,將上述試管放在37水浴箱內(nèi)30分鐘觀察有無溶血現(xiàn)象。 將不溶血試管離心，3000rpm，5min，使紅細胞沉淀。 將2、3號管上清液分別移入5、6管，按下表加入試劑,實驗方法,將上述5支試管放入37水浴箱內(nèi)30min觀察有無溶血現(xiàn)象