1、蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)分析,蛋白質(zhì)組學(xué),DNA,mRNA,蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)錄,翻譯,基因,蛋白質(zhì),細胞特異性基因表達,生理狀態(tài),蛋白質(zhì)相互作用,溫度,應(yīng)激狀態(tài),培養(yǎng)條件,藥物作用,數(shù)量有限,結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定,復(fù)雜性,多變性,直接反應(yīng)生命現(xiàn)象,復(fù)雜的調(diào)控,蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義,蛋白質(zhì)組 protein + genome proteome 一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì) 一個細胞或一個機體的基因所表達的全部蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)組學(xué) 旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式與功能模式 從整體的角度分析、鑒定細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、表達水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋

2、白質(zhì)的功能與細胞生命活動的規(guī)律,一、蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義,蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點的分離與分析,根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、分子大小及形狀、電離性 質(zhì)、生物學(xué)功能的差異進行： 1、根據(jù)溶解度 2、根據(jù)分子量 透析和超濾 平衡離心 凝膠過濾層析,（三）蛋白質(zhì)混合物的分離方法,一、分 離 純 化,3 、根據(jù)電荷 毛細管電泳 離子交換層析,一、分 離 純 化,4 、根據(jù)蛋白質(zhì)的親和能力 親和層析,（四） 蛋白質(zhì)分離純化的條件,緩沖液 鹽、金屬離子和螯合劑 還原劑 去垢劑 蛋白酶抑制劑 表面效應(yīng) 蛋白質(zhì)的環(huán)境因素 溫度 儲存,一、 分 離 純 化,二、分析鑒定,（一）Western印跡技術(shù) 基本操作步驟： 蛋白樣

3、品的制備 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移 蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合反應(yīng) 目標(biāo)蛋白質(zhì)的顯示,western 印跡基本步驟圖示,Western免疫印跡,用于測定特定蛋白質(zhì)的大小和含量, 基本原理,將經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白組分從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體上，以針對特定蛋白質(zhì)的抗體作為探針，與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位進行特異性反應(yīng)，結(jié)合上的抗體可用二抗檢測。,常用的二抗是與辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白或A蛋白；實際應(yīng)用中常常還需要設(shè)置適當(dāng)?shù)膶φ铡?常需要內(nèi)參蛋白量化蛋白量； GAPDH、ACTIN、ALBUMIN ,將SDS-PAGE的高分辨能力與抗原抗體

4、反應(yīng)的特 異性、敏感性相結(jié)合 (靈敏度達到ng級) 蛋白電泳在變性條件下進行，消除了蛋白溶解、 聚集以及與外來蛋白共沉淀等問題, 特點,免疫熒光法(immunofluorescence),主要用于檢測目的蛋白在細胞內(nèi)的定位。, 基本原理,將待檢的目的蛋白作為抗原，固定在載玻片上，先加上針對目的蛋白的抗體(第一抗體)進行反應(yīng)，再加上針對第一抗體的熒光素標(biāo)記抗體(第二抗體)進行反應(yīng)，稱作間接免疫熒光法。如果將熒光素標(biāo)記在第一抗體上，則不用再加第二抗體，稱作直接免疫熒光法。, 特點, 需要在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果； 無法檢測目的蛋白的大??； 操作簡便，但需設(shè)立必要的對照；,免疫熒光法(immunofl

5、uorescence),例 1,例 2,免疫沉淀(immunoprecipitation)技術(shù), 將抗體加入蛋白混合溶液，使之與相應(yīng)抗原結(jié)合； 加入固定的抗體結(jié)合蛋白 (如: Protein A-瓊脂糖珠)； 經(jīng)離心后，與Protein A結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物便可沉淀 ； 將樣品變性后即可獲得游離的抗原蛋白 ；, 基本步驟, 基本原理,利用一種可離心沉淀的抗體結(jié)合蛋白(如Protein A, Protein G等)，將抗原-抗體復(fù)合物從蛋白混合溶液中分離，進行定量或定性研究。,為方便后續(xù)分析，在免疫沉淀前，常會對抗原進行標(biāo)記。,免疫共沉淀 (co-IP)技術(shù),基于與蛋白質(zhì)X的生理性相互作用，

6、如果用蛋白X的抗體免疫沉淀X，則蛋白質(zhì)Y也可能沉淀下來。Y的這種免疫沉淀被稱為免疫共沉淀(co-immunocipitation, Co-IP)，此法最常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的結(jié)合。,Y,裂解細胞 免疫共沉淀蛋白質(zhì)X,（二）二維凝膠電泳（2-DE),是目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一 由兩相組成： 第一相：等電聚焦凝膠電泳 根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異 第二相：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異,二、分析鑒定,二維雙向電泳(2D electrophoresis), 基本原理,基于等電點與分子量分離蛋白質(zhì),IEF-focused proteins,SDS-charged pr

7、oteins in IPG strip,SDS-charged proteins resolved according to sizes in SDS-PAGE gel,2-DE原理示意圖,二、分析鑒定,2-DE分析的基本步驟,蛋白質(zhì) 溶解 變性 還原 去除蛋白 質(zhì)雜志,利用不同 pK固定化 電解質(zhì)可 配置不同 pH范圍的 凝膠或利 用商業(yè)化 軟件設(shè)計,第一相電泳： IPGIFE 平衡 第二相電泳： SDSPAGE,考馬斯亮 藍染色、 銀染色、 銅染色,樣品制備,IPG膠制備,雙相電泳,染色,二、分析鑒定,2-DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜,二、分析鑒定,優(yōu)點：可以同時直觀顯示數(shù)千個蛋白質(zhì)點； 缺點：耗

8、時，耗力，目前無法自動化；難以分離疏水、具極端分子量 或等電點的蛋白質(zhì)（如膜受體蛋白、組蛋白等）。,二維雙向電泳(2D electrophoresis),silver staining (3000 spots),蛋白質(zhì)染色,考馬斯亮藍染色 銀染：靈敏度高；“雪崩”效應(yīng)；末端封閉 銅染,通過2-DE得到的蛋白質(zhì)分離圖譜，需要經(jīng)過攝像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為基礎(chǔ)的、具有不同灰度強弱和一定邊界方向的斑點電腦信號。,(三)圖像分析技術(shù),二、分析鑒定,2-DE圖像分析軟件包操作過程：,圖像采集,斑點檢測,背景消減,獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息,圖像內(nèi)及圖像間的比較,二、分析鑒定,放射性核素標(biāo)記親和標(biāo)簽法,正常細胞 D

9、0親和標(biāo)簽,病理細胞 D8親和標(biāo)簽,混合并消化,生物素親和純化,液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析,測量兩個不同樣品中蛋白質(zhì)的相對豐度,二、分析鑒定,蛋白芯片(protein chip)技術(shù),將一系列“誘餌”蛋白以陣列方式固定在經(jīng)過特殊處理的底板上，然后將其與待分析的樣品雜交，只有那些和“誘餌”結(jié)合的蛋白才被保留在芯片上。其實質(zhì)是酶聯(lián)免疫吸附測定。,基于蛋白質(zhì)表面化學(xué)及質(zhì)譜檢測的高通量蛋白質(zhì)分析技術(shù),蛋白芯片(protein chip)技術(shù), 基本方法, 蛋白質(zhì)的結(jié)合：未經(jīng)處理的樣品(如血清，尿液等)直接點在芯片 上，根據(jù)芯片表面不同的化學(xué)或生物特性結(jié)合相應(yīng)的蛋白質(zhì)； 清洗減少非特異性蛋白(如鹽及其它污染物

10、)的結(jié)合； 加能量吸收分子(EAM)：EAM能有效的吸收激光的能量，使樣品 分子進入氣相并得到電離； 用表面增強的激光解吸電離法(SELDI)將保留在芯片上的蛋白質(zhì) 洗脫下來； 電離的蛋白質(zhì)可以通過飛行時間質(zhì)譜儀精確地測定它們的質(zhì)量；,蛋白芯片(protein chip) 技術(shù),從未經(jīng)提純的生物或臨床樣品中直接捕獲、檢測 和分析蛋白質(zhì)不需任何標(biāo)記或加尾 超高的檢測靈敏度 (1-50 fmole的蛋白質(zhì)) 從超小樣品體積(0.5 l)到大體積(400l) 快速獲取實驗結(jié)果,蛋白芯片(protein chip) 技術(shù), ProteinChip的應(yīng)用,蛋白質(zhì)芯片,原理 樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子

11、間的質(zhì)量和 電荷比值（質(zhì)荷比，m/e）的差異確定分子量。 應(yīng)用 蛋白質(zhì)的序列分析 研究蛋白質(zhì)的修飾,（五）質(zhì)譜技術(shù),二、分析鑒定,（六） 其它方法,Edman降解法測定蛋白質(zhì)多肽的排列順序。 核磁共振（NMR）、熒光光譜法測定溶液中蛋白質(zhì) 分子的結(jié)構(gòu)。 X射線衍射分析法、小角中子衍射法測定晶體蛋白 質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)等。,二、分析鑒定,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及其應(yīng)用,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及其應(yīng)用,二、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用,一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Database),一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,（一）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫,（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫,（三）蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫,（四）DIP數(shù)據(jù)庫,一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,（一）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫： http:/www.ebi.ac.uk/swissprot PIR和PSD數(shù)據(jù)庫 / /pir,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)倉庫 /pdb/ 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫 http:/scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/ PROSITE數(shù)據(jù)庫 http:/www.expasy.ch/proside/,（二