1、實(shí)驗(yàn)一 收集動(dòng)物組織的活細(xì)胞并計(jì)數(shù)和測(cè)定成活率,問 題,如何知道每升血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板的數(shù)量？ 如何知道水樣中某小型生物的數(shù)量？ 如何知道發(fā)酵液中啤酒酵母的密度？ 如何知道生物制劑生產(chǎn)罐中細(xì)胞的密度？,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)機(jī)械分離法獲得動(dòng)物組織的活細(xì)胞 學(xué)會(huì)使用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度 掌握活細(xì)胞和死細(xì)胞的鑒別方法,收集動(dòng)物組織的活細(xì)胞,從組織中分離單細(xì)胞的方法有多種： 對(duì)于較為柔軟的組織（如肝臟、脾臟），可以采用機(jī)械研磨的方法分離細(xì)胞，但這會(huì)造成一些細(xì)胞的損傷而降低細(xì)胞的成活率； 對(duì)于比重差異較大的細(xì)胞，可以采用離心的方法來分離，例如血液中各種血細(xì)胞的分離； 對(duì)于股骨中骨髓細(xì)胞的

2、分離，則可以采取沖洗股骨腔的方法獲得。,實(shí)驗(yàn)材料,小鼠 小鼠的抓法： 從鼠籠內(nèi)將小鼠尾部抓住并提起，放在磁盤上或報(bào)紙上。,小鼠的處死：頸椎脫位法 右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉，同時(shí)左手（右手）拇指與食指用力向下按住小鼠頭部，在顱骨基部的后側(cè)與頸椎兩側(cè)，施加壓力，使頭顱和腦一起與脊髓分離。當(dāng)脊髓與腦分離時(shí)，伴有大量的肌肉活動(dòng)。經(jīng)研究證明，這種方法能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)痛覺不再敏感。,脾臟淋巴細(xì)胞懸液的制備,1.機(jī)械分離法 用鑷子將脾臟置于尼龍布上，用注射器推棒輕輕擠壓組織，使細(xì)胞分散。將尼龍布置于玻璃漏斗中，用D-Hanks 液沖洗尼龍布，收集細(xì)胞懸液于離心管中。 2.低滲溶解紅細(xì)胞（紅細(xì)胞溶血） 0

3、.87% NH4Cl 溶液,股骨骨髓細(xì)胞懸液的制備,沖洗骨髓腔 ： 用剪刀剪開股骨的一端，將注射器針頭插入股骨開口端。然后用剪刀剪開股骨的另一端，用D-Hanks液多次沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液于離心管中。,D-HANKS液(無鈣鎂離子的HANKS液) 配方,NaCl 80.0克 Na2HPO42H2O 0.6克 （如為12H2O，則需1.2克） KCl 4.0克 KH2PO4 0.6克 雙蒸水 1000毫升 原液稀釋10倍即為使用液- D-Hanks液,細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率,利用單細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，通常需要確定細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度和活細(xì)胞的數(shù)量，這就要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率的測(cè)定。 細(xì)胞

4、計(jì)數(shù)一般用血球計(jì)數(shù)板，細(xì)胞存活率的測(cè)定一般采用染色法。 細(xì)胞密度：每ml細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞成活率：總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比,血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu),血球計(jì)數(shù)板是特制的厚載玻片，中央?yún)^(qū)域有四條凹槽而形成三個(gè)平臺(tái)，中間平臺(tái)較寬，它又被一短橫槽分隔為兩部分，每一部分均有一個(gè)方格網(wǎng)。,每一方格網(wǎng)可分為九個(gè)大方格。 四角4個(gè)大方格分別被分為16個(gè)中方格。 中央大方格分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又可分為16個(gè)小方格。中央大方格共含有400個(gè)小方格。,雙線分隔,血球計(jì)數(shù)板的原理,白細(xì)胞計(jì)數(shù)法采用四角4個(gè)大方格的區(qū)域，適用于細(xì)胞較大數(shù)量較少的樣品 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法采用中央大方格的區(qū)域,血球計(jì)數(shù)板的原理,計(jì)數(shù)室大

5、方格邊長(zhǎng)為1mm，面積為1mm2，中間平臺(tái)與蓋玻片之間的距離（高）為0.1mm，所以每個(gè)大方格的固定容積為0.1mm3。,血蓋片,計(jì)數(shù)室,血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)公式1,每個(gè)大方格的總體積為0.1mm3 1 ml =1000 mm3, 0.1 mm3 = 10- 4 ml 每角大方格的細(xì)胞數(shù)10000 = 細(xì)胞數(shù)/ml 4角大方格中細(xì)胞總數(shù) 細(xì)胞密度= 104 4 稀釋倍數(shù)= 細(xì)胞數(shù)/ml懸液,計(jì)數(shù)規(guī)則,位于格線上細(xì)胞只計(jì)上邊線和左邊線上的， 即“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右” 由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。,注意事項(xiàng),向血球計(jì)數(shù)板加樣前，須將細(xì)胞懸液充分搖勻； 加樣過程中，應(yīng)避免將細(xì)胞懸液

6、滴在蓋玻片（血蓋片）上，避免有氣泡產(chǎn)生； 細(xì)胞懸液密度過大時(shí)，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再計(jì)數(shù) 。,加樣處,細(xì)胞密度的結(jié)果記錄,在10的低倍鏡下計(jì)數(shù)，細(xì)胞為透亮的小圓點(diǎn)。,細(xì)胞成活率的測(cè)定,利用染色法，判斷細(xì)胞的死活； 活細(xì)胞的細(xì)胞膜具有選擇通透性，不能被 臺(tái)盼藍(lán)染色，呈無色透明狀； 死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增大，被染成藍(lán)色； 細(xì)胞總數(shù)死細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞存活率= 100% 細(xì)胞總數(shù),在載玻片上操作,注意事項(xiàng),應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成細(xì)胞存活率的測(cè)定，否則活細(xì)胞會(huì)被染料毒死而著色，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性； 應(yīng)在幾個(gè)視野下計(jì)算死活細(xì)胞的數(shù)量，避免人為因素的干擾； 可以在40倍的高倍鏡下，計(jì)算視野中的細(xì)胞總數(shù)和其中的死細(xì)胞數(shù)。,細(xì)

7、胞成活率的結(jié)果記錄,血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)公式2,中央大方格的總體積為0.1mm3 中央大方格的細(xì)胞數(shù)1000 = 細(xì)胞數(shù)/ml 5個(gè)中方格中細(xì)胞總數(shù) 細(xì)胞密度= 25 104 5 稀釋倍數(shù)= 細(xì)胞數(shù)/ml懸液,每一方格網(wǎng)可分為九個(gè)大方格。 中央大方格分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又可分為16個(gè)小方格。中央大方格共含有400個(gè)小方格。,雙線分隔,實(shí)驗(yàn)報(bào)告,實(shí)驗(yàn)過程中將原始數(shù)據(jù)記錄在實(shí)驗(yàn)講義中； 在實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算和結(jié)果分析； 回答問題； 閱讀文獻(xiàn)資料。,成 績(jī),每次實(shí)驗(yàn)報(bào)告均打分并累計(jì)為平時(shí)成績(jī)； 如發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和作業(yè)的抄襲，抄襲者和被抄襲者的成績(jī)均記為0分。,顯微鏡的組成部分,調(diào)節(jié)瞳間距調(diào)節(jié)屈光度,所需物鏡、 聚焦,5、,4、,1、,40X