1、分子生物學(xué)研究法,一.重組DNA技術(shù)概論 二.常見的DNA操作技術(shù) 三.基因克隆技術(shù) (狹義) 四.基因表達(dá)研究技術(shù) 五.基因芯片及數(shù)據(jù)分析 六.蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究技術(shù),一.重組DNA技術(shù)概論,二.常見的DNA操作技術(shù),2.1 瓊脂糖凝膠電泳 2.2 SDS-PAGE 電泳 2.3 PCR技術(shù) 2.4 測序技術(shù) 2.5 雜交技術(shù) 2.6 ELISA 技術(shù) 2.7 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 2.8 cDNA文庫 2.9 SNP技術(shù)及應(yīng)用 2.10 基因打靶,瓊脂糖凝膠電泳,1、原理： 2、用途： 3、技術(shù)要點(diǎn),瓊脂糖凝膠電泳的原理,1. DNA電泳遷移：電荷效應(yīng)分子篩效益 （1）DNA帶負(fù)電，電場中，向正極移動

2、； （2）決定移動速度三因素：DNA大小，電荷數(shù)，構(gòu)型； ( 3) 線性DNA分子移動速度與其分子質(zhì)量的對數(shù)成反比； （分子量越大，跑得越慢） 2、檢測原理： （1）溴化乙錠（EB）可插入雙鏈DNA分子中，在紫外光照射下，發(fā)射熒光。,瓊脂糖凝膠電泳用途,1. DNA分子量測定（距離分子量） 2. 基因，克隆的鑒定（通過1完成） 3、不同長度的基因片斷的分離 4、DNA濃度的測定 （熒光的強(qiáng)度與DNA含量成正比） *也可用于蛋白的分離鑒定,加標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA Marker,測定分子量 加標(biāo)準(zhǔn)濃度的DNA，測定濃度,瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)要點(diǎn),1.不同濃度凝膠分辨DNA片段能力不一樣 (p33) (1

3、)低: 不利于小片段的分辨(擴(kuò)散) (2)高: 不利于大片段的分辨(遷移不動) (3) 一般選1.0% 2. 凝膠要用緩沖液配( TBE 或 TAE ) 3. EB強(qiáng)致癌，帶手套操作； 4. agarose (瓊脂糖）電泳 agar(含瓊脂糖和瓊脂膠）平板培養(yǎng)基,SDS-PAGE 電泳,1、原理 2、用途 3、技術(shù)要點(diǎn),SDS-PAGE 電泳原理,1.SDS(帶負(fù)電)和還原劑破壞蛋白的高級結(jié)構(gòu), 同時SDS與蛋白定量結(jié)合, 消除蛋白之間的電荷差異,使得蛋白的遷移率主要依賴分子量 (分子小跑得快) . 2.不連續(xù)電泳: 上層為濃縮膠,可將樣品壓縮到同一起跑線, 下層為分離膠; 可獲得更高的分辨率

4、. 3.考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色.,SDS-PAGE 電泳用途,1.蛋白分子量的測定 2.蛋白濃度的測定 3.蛋白的鑒定(通過1來實(shí)現(xiàn)),SDS-PAGE 技術(shù)要點(diǎn),1.濃縮膠一般用5%, 分離膠:次高分子(10萬-20 萬)用7%, 低分子(1.4萬10萬）用12 2、PAGE配制時帶手套，（Acr-Bis液體有積累性神經(jīng)毒，聚合后無毒) 3.SDSPAGE測定的是單體蛋白分子量；（多亞基不行） 4、SDSPAGE不適于： （1）電荷異常蛋白：組蛋白（電多） （2）構(gòu)象異常的 蛋白 （3）帶有較大輔基的蛋白糖蛋白，脂蛋白。,PCR技術(shù),1、原理 2、應(yīng)用 3、技術(shù)要點(diǎn),PCR技術(shù)原理,循環(huán)過程(3

5、2 次左右） 1.解鏈：94 , 30 s 2.引物結(jié)合: ？ ，30 s 3. 延伸：72 ，？Min 特點(diǎn) 1. 引物兩條，以2n指數(shù)擴(kuò)增（前20-25次），后面擴(kuò)增效率降低，30次以后，基本進(jìn)入平臺期。 2. 引物結(jié)合溫度？ 一般為50-55 ， 需要調(diào)整； 3. 延伸時間？Min需要調(diào)整，一般1kb / min.,PCR技術(shù)應(yīng)用,1. 基因檢測； 2. 基因的制備（包括基因的修飾）,PCR技術(shù)操作要點(diǎn),1. 靈敏度高，防止污染，出現(xiàn)假陽性(帶手套，設(shè)立陰性，陽性對照）； 2. 需要摸索結(jié)合溫度，提高擴(kuò)增的特異性。,雜交技術(shù),1. Southern blot-檢測DNA 2. North

6、ern blot-檢測RNA 3. Western blot - 檢測蛋白,Southern blot , Northern blot和Western blot 比較,ELISA 原理和用途類似于Western blot,但在酶標(biāo)板中操作，無需SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜，操作簡單，可批量檢測，并可半定量測定。,Southern blot,Northern blot,Western blot,雙脫氧法測序(Dudeoxy sequence analyses),雙脫氧法又稱末端終止法，用于單鏈測序 1.原理： Atkinson發(fā)現(xiàn)用 DNA pol 合成DNA時如在反 應(yīng)物中加入一定量的 2,3ddTT

7、P 時，因ddT 的3碳原子不含OH,故DNA不能延伸。 1982年Sanger 利用此原理建立了雙脫氧測序法。原理和加減法相似，但不再是加一種dNTP或減一種dNTP,而是加入某一種雙脫氧核苷，來終止聚合反應(yīng)。用此法測得G4含5577bp.,2.1 細(xì)菌轉(zhuǎn)化,通常情況下，外源基因無法進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)； 當(dāng)用電擊法，或CaCl2，或RuCl等方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源基因進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。 感受態(tài)細(xì)胞的活性較低，處理需溫柔。,2.2 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 技術(shù),PCR的基本原理 變性、復(fù)性、半保留復(fù)制 PCR三步曲 變性 9097 退火 4555 延伸 72,PCR,

8、2.3 cDNA文庫,cDNA: (1) 將mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA. (2) 特點(diǎn): A.穩(wěn)定; B.無內(nèi)含子. 二. cDNA文庫: (1) 代表了生物體某一器官或者組織mRNA中所含的全部或絕大部分遺傳信息. (2) 特點(diǎn): A.不同的生物, 同一生物不同組織, 同一組織不同發(fā)育時間或不同生理狀態(tài)下, cDNA文庫不同; B.建好的cDNA文庫的具體的信息未知,僅提供吊取相關(guān)目的基因的材料. C.每個克隆不一定是全長基因,cDNA文庫建庫過程,1.高質(zhì)量mRNA的制備; 2.反轉(zhuǎn)錄生成cDNA 3.與載體分子連接(噬菌體文庫) 4.轉(zhuǎn)染(噬菌體的包裝),說明: 引物 oligo dT

9、, 隨機(jī)引物R6 (得到全長cDNA) 兩端可加上酶切接頭,便于克隆到載體上. 合成時,原料用甲基化的dCTP. 防止酶切時損傷內(nèi)部序列. 轉(zhuǎn)化效率要高, 防止少量表達(dá)的mRNA未得到克隆.,2.4 SNP技術(shù)及應(yīng)用,Single nucleotide polymorphism 單核苷酸多態(tài)性 (標(biāo)記) 是指同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性 。 用途: (1) 遺傳的分子標(biāo)記-物種鑒定 (2) 生物功能異常的基因標(biāo)記-疾病的檢測;,Single nucleotide polymorphism,SNP的特征,SNP是人類可

10、遺傳的變異中最常出現(xiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，在人類基因組中廣泛存在，大約平均1000個堿基對就會出現(xiàn)一個SNP，估計整個人類基因組30億堿基中至少有300萬個SNP。 SNP大都表現(xiàn)為二等位基因（bialletic)多態(tài)性,即在該位置只存在兩種不同的堿基。 SNP作為一種堿基的替換，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換（CT，GA），也可能是顛換。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，而且在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，多是發(fā)生CT的轉(zhuǎn)換，原因是CG中的C是甲基化的，它能自發(fā)的脫氨基而替換為胸腺嘧啶。,SNP的檢測方法,單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformational polymorp

11、hism,SSCP) 原理：單鏈DNA的折疊結(jié)構(gòu)是由單核苷酸序列決定的，當(dāng)某一個堿基發(fā)生突變時，便會直接影響該鏈的構(gòu)象，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移率會發(fā)生改變。,變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理:當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性溫度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。,熒光共振能量傳遞(fluorescent resonance energy transfer, FRET),供者,受者,探針,

12、5,3,Taqman法,分子信標(biāo)(molecular beacon)法,高效液相色譜 -質(zhì)譜分析法 DNA芯片技術(shù)（DNA chip）,SNP數(shù)據(jù)庫,美國國立生物技術(shù)信息中心 /snp 德國的HGBAS網(wǎng)站 http:/www.hgbas.cgr.ki.sei 日本JST的數(shù)據(jù)庫 http:/snp.ims.u-tolkyo.ac.jp,2.5基因打靶(gene targeting),通過DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究該基因的功能。(反向遺傳學(xué)) 基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(g

13、ene knockin)：定向替代,基因打靶的必備條件,胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞) 能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性 打靶載體 Neo（新霉素）陽性篩選標(biāo)志 HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase),基因敲除的基本程序,打靶載體的構(gòu)建 打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換 基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宮中 嵌合體的雜交育種,基因敲除 Knockout,1.完全基因敲除-可能會致死. 2.條件型基因敲除 Cre/LoxP, FLP / FRT,基因敲除的缺點(diǎn),能將基因與表型(生物功能)聯(lián)系起來,但

14、不能提供具體的作用機(jī)制; 對多基因決定的表型無法將其聯(lián)系全部找出; 操作復(fù)雜,成本高.,三.基因克隆技術(shù)(狹義)獲取目的基因的技術(shù),1. RACE 技術(shù) 2. cDNA差示顯示法 3.基因大規(guī)模克隆技術(shù) 4.酵母雙雜交法 5.酵母單雜交系統(tǒng) 6.基因的圖位克隆法,3.1 RACE 技術(shù),Rapid amplification of cDNA ends 已知基因一端序列, 快速獲取另一端序列. 5 RACE (獲取5序列) 3 RACE (獲取3序列) 需要合成引物接頭(單鏈DNA), 用RNA ligase將基因(RNA)與引物(DNA)連接.,5 RACE,3 RACE (非mRNA擴(kuò)增),

15、合成兩條互補(bǔ)的引物, 序列任意.及一條序列特異的引物 互補(bǔ)引物中一條5標(biāo)記 Pi, 通過RNA ligase 將其與RNA連接.,3.2 cDNA差示顯示法(cDNA-RDA),僅知道生理功能, 性狀,對基因序列一無所知.獲得該相關(guān)基因的方法. 原理: A.樣本(sample)與對照(control)mRNAs被轉(zhuǎn)錄成cDNA, 酶切加可PCR擴(kuò)增接頭, 擴(kuò)增后除去接頭,只有樣本被加上新接頭(可PCR擴(kuò)增). B. 樣本(ss)與過量對照(cc)雜交后, PCR擴(kuò)增. sc被線形擴(kuò)增;ss被指數(shù)擴(kuò)增; CC不被擴(kuò)增.,3.3 基因大規(guī)?？寺〖夹g(shù)(Gateway 克隆技術(shù)),1. 不需要酶切,連

16、接; 2. 利用TOPO反應(yīng),將PCR產(chǎn)物克隆到Entry載體; 再通過LR反應(yīng), 將基因定點(diǎn),定向重組到表達(dá)載體. 3.上游引物5端需要引入CACC序列.,3.4 酵母雙雜交法（蛋白蛋白相互作用）,1.篩選與已知蛋白相互作用的蛋白基因 2.真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子基本結(jié)構(gòu) 一般有2個功能域（functional domain） DNA結(jié)合域（DNA-binding domain）DBD 轉(zhuǎn)錄激活域（transcription-activating domain）-AD (許多激活子還有二聚體化域, 有的還有受體結(jié)合域),“獵物”為一個庫； 將不同的“誘餌”克隆后，捕獲不同的“獵物”,.5 酵母單

17、雜交（蛋白核酸相互作用）,用于鑒定與特定順式作用元件（DNA序列）作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合域或反之,.6 基因的圖位克隆法,目的：克隆具有某種表型的未知基因的方法 原理：略,四.基因表達(dá)研究技術(shù),.基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE) 2. RNA選擇性剪切機(jī)制 3.原位雜交技術(shù) .定點(diǎn)突變技術(shù) RNAi技術(shù),4.基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE),以測序?yàn)榛A(chǔ)的定量分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種類型細(xì)胞或組織的基因表達(dá)信息； 理論依據(jù)：堿基的核酸片段可代表一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特異序列（序列標(biāo)簽） 某序列標(biāo)簽占總標(biāo)簽數(shù)的比例對應(yīng)編碼基因的表達(dá)頻率,4.2. RNA選擇性剪切機(jī)制,R

18、T-PCR擴(kuò)增不同組織特異基因 電泳分析片段大小是否一致,.3.原位雜交技術(shù),通過標(biāo)記的核酸探針, 在組織,細(xì)胞,間期核及染色體上對核酸進(jìn)行定位和相對定量研究的一種手段. (1) RNA原位雜交-組織切片中,該基因的表達(dá)產(chǎn)物(mRNA)在細(xì)胞水平上作出定性定量分析.-區(qū)別 免疫組化(蛋白) (2) 染色體原位雜交-eg. 熒光原位雜交(FISH), 確定DNA序列染色體上的位置.,4.3 定點(diǎn)突變,1.研究某個氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),功能的影響; 2.改造DNA調(diào)控序列,修飾表達(dá)載體,引入新的酶切位點(diǎn).,TaKaRa mutation kit,4.4 RNAi技術(shù),RNAi是指dsRNA誘導(dǎo)

19、產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)同源基因表達(dá)阻斷的生物學(xué)現(xiàn)象。在線蟲、昆蟲、哺乳動物、植物和真菌中廣泛存在。是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）的重要機(jī)制。細(xì)胞利用RNAi抵御病毒和其它外源核酸的侵染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。,雙鏈RNA先被切割酶Dicer切割成2123 個堿基對的siRNA中間體，觸發(fā)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）。在ATP的存在下，復(fù)合物中雙鏈RNA被螺旋酶解旋，形成單鏈RNA（ssRNA）的活化體。一旦單鏈RNA同目的mRNA配對，核酸酶被活化，在復(fù)合物內(nèi)部降解 mRNA。,RNAi的應(yīng)用,基因功能的研究：RNAi作為一種反相遺傳工具，可通過抑制特定基因的表達(dá)來研究該基因功能。 基因治療：可用于

20、抑制參與病程的開始或發(fā)展的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，例如參與病毒或寄生蟲與宿主相互作用、病原體的復(fù)制、癌癥的發(fā)生及細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)。,RNAi的缺點(diǎn),A. 在哺乳動物中，存在非特異性效應(yīng)的dsRNA觸發(fā)途徑,如（1）dsRNA依賴的蛋白激酶(PKR)和干擾素途徑，該途徑引起對蛋白合成和凋亡的全身性的抑制；(2) dsRNA誘導(dǎo)的25多聚腺苷酸的合成，該途徑導(dǎo)致非特異性的RNA酶即RnaseL的活化。但PKR不能被少于30個核苷的dsRNA活化，可以通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計盡量避免。但非特異性RNAi效應(yīng)有時還是存在，而且不可預(yù)測。 對有的高表達(dá)的基因，RNAi可能會無效或效果不明顯。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的RNAi效果比較短暫（

21、約1周左右）。 對一個基因設(shè)計的不同片段的RNAi可能效果差異很大，篩選的工作量繁重。有時細(xì)胞導(dǎo)入效率低下，也增加了技術(shù)實(shí)現(xiàn)的難度。,4.5 生物芯片技術(shù),生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)，它主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固格體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。,主要特點(diǎn),高通量、微型化和自動化。芯片上集成的成千上萬的密集排列的分子微陣列，能夠在短時間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍。但目前的成本較高，重復(fù)性較差。,生物芯片分

22、類 (1) -用途,1 . 樣品制備芯片 2. 生化反應(yīng)芯片（如PCR芯片） 3. 檢測芯片 （如基因芯片，蛋白芯片） 4. 芯片實(shí)驗(yàn)室 （是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。它將樣品的制備、生化反應(yīng)到檢測分析的整個過程集約化形成微型分析系統(tǒng)）。,生物芯片分類 (2) -制造技術(shù),六. 蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究技術(shù),1.雙向電泳 2.質(zhì)譜技術(shù) 3.蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 4.EMSA 5.噬菌體展示技術(shù) 6.免疫共沉淀技術(shù) 7.蛋白質(zhì)磷酸化分析,6.1 雙向電泳,雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)中對蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究的主要分離方法，同時能分離成百上千種蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在第一向根據(jù)電荷的不同（等電聚焦），第二向根據(jù)分子量的不同進(jìn)行分離（SDS-PAGE）。分離后對蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，根據(jù)實(shí)際分析情況，分別進(jìn)行考馬斯亮蘭染色、銀染或熒光染色。掃描后用相關(guān)軟件（PDQUEST等）進(jìn)行圖譜分析，分析差別點(diǎn)等。雙向電泳與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，還可以進(jìn)一步分析差別點(diǎn)蛋白的特性。,6.2 MS質(zhì)譜技術(shù),質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比(m/z)的差異來分析蛋白質(zhì)和多肽的分子量和對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，磷酸化蛋白質(zhì)分析、糖基化蛋白質(zhì)分析、ICAT差異定量、多肽DE NOVO序列分析、復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物酶解和shotgun鑒