1、1,第一節(jié) 島津LC-10AT型HPLC操作規(guī)程,2,目的:規(guī)范島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。 范圍:適用于島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。 職責(zé):操作員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。,3,一、 系統(tǒng)組成,本系統(tǒng)由1個(gè)LC-10ATvp溶劑輸送泵、Rheodyne 7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、SPD-10Avp紫外-可見檢測(cè)器、N2000色譜數(shù)據(jù)工作站和電腦等組成，另外還包括打印機(jī)。,4,二、 準(zhǔn)備,1 、準(zhǔn)備所需的流動(dòng)相，用合適的0.45m濾膜過(guò)濾，超聲脫氣20min。 2 、根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的色譜柱（注意方向）和定量環(huán)。 3、 配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液，用合適的0.45m濾膜過(guò)濾

2、。（注意腐蝕性與有機(jī)系的的溶劑） 4 、檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常。,5,接通電源，依次開啟不間斷電源、 泵、檢測(cè)器，待泵和檢測(cè)器自檢結(jié)束后，打開打印機(jī)、電腦顯示器、主機(jī)，最后打開色譜工作站。,三、 開機(jī),6,四、 參數(shù)設(shè)定,1、 波長(zhǎng)設(shè)定：在檢測(cè)器顯示初始屏幕時(shí)，按func鍵1次，波長(zhǎng)數(shù)字鍵閃動(dòng)，輸入所需波長(zhǎng)值，按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出到初始屏幕。 2 、流速設(shè)定：在泵顯示初始屏幕時(shí)，按func鍵，用數(shù)字鍵輸入所需的流速（流速一般為超過(guò)1ml/min），按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出,7,五、 更換流動(dòng)相并排氣泡,1： 將管路的吸濾器放入裝有準(zhǔn)備好的流動(dòng)相

3、的儲(chǔ)液瓶中； 2 ：逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)泵的排液閥180，打開排液閥； 3 ：按泵的purge鍵，pump指示燈亮，泵大約以9.9ml/min的高流速?zèng)_洗，3min（可設(shè)定）后自動(dòng)停止，一般視管路無(wú)氣泡即可。 4 ：將排液閥順時(shí)針旋轉(zhuǎn)到底，關(guān)閉排液閥。 5 ：如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。 6 ：如按以上方法不能排盡氣泡，從柱入口處拆下連接管，放入廢液瓶中，設(shè)流速為5ml/min，按pump鍵，沖洗3min后再按pump鍵停泵，重新接上柱并將流速重設(shè)為規(guī)定值。,8,六、 平衡系統(tǒng),1、查看基線： 1.1：按N2000色譜數(shù)據(jù)工作站操作規(guī)程打開“在線色譜工作站”軟件， 1.2：輸入實(shí)驗(yàn)信息

4、并設(shè)定各項(xiàng)方法參數(shù)后， 1.3：按下“數(shù)據(jù)收集”頁(yè)的 按鈕。,9,六、 平衡系統(tǒng),2 、 2.1 ：按泵的pump鍵，泵啟動(dòng)，pump指示燈亮。用檢驗(yàn)方法規(guī)定的流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)，一般最少需6倍柱體積的流動(dòng)相。 2.2 ：檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。 2.3 ：觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動(dòng)應(yīng)不超過(guò)1MPa。如超過(guò)則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按檢查管路后再操作。 2.4 ：觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移0.01mV/min，噪聲為0.001mV時(shí)，可認(rèn)為系統(tǒng)已達(dá)到平衡狀態(tài)，可以進(jìn)樣。,10,七、 進(jìn)樣,1 、進(jìn)樣前按檢測(cè)器zero鍵調(diào)零，按軟件中 零點(diǎn)校正 按鈕校正基線零

5、點(diǎn)，再按一下 查看基線 按鈕使其彈起。 2 、用試樣溶液清洗注射器，并排除氣泡后抽取適量即可以進(jìn)樣了。 3、含量測(cè)定的對(duì)照溶液和樣品供試溶液每份至少進(jìn)樣2次 。,11,八、 譜圖的判斷 及結(jié)果計(jì)算,系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：三個(gè)重要指標(biāo) 分離度（加強(qiáng)）：一般應(yīng)1.5。 重復(fù)性：兩次譜圖的峰面積應(yīng)相差不超過(guò)1%。 理論塔板數(shù)：應(yīng)規(guī)定的理論塔板數(shù)目。 拖尾因子：0.95T1.05 保留時(shí)間：對(duì)照與樣品的主成分保留時(shí)間應(yīng)大致一致。 RSD： 3%,12,八、 譜圖的判斷 及結(jié)果計(jì)算,1、內(nèi)標(biāo)法 用含對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式算出校正因子（f）： 其中 As和Ar分別為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和對(duì)照品的

6、峰面積或峰高，ms和mr分別為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和對(duì)照品的量。,13,八、 譜圖的判斷 及結(jié)果計(jì)算,2、外標(biāo)法： 用含對(duì)照品的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式計(jì)算比值（r）：r=mr/Ar（其中 mr和Ar分別為對(duì)照品的量和相應(yīng)的峰面積或峰高。 ） 再根據(jù)供試品溶液的色譜峰響應(yīng)值，計(jì)算供試品中被測(cè)成分的含量（mi）：mi=rAi（其中 Ai為供試品溶液中被測(cè)成分的峰面積或峰高）。 必要時(shí)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量和標(biāo)示量折算成標(biāo)示量的百分含量，或根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量折算成百分含量。,14,九、 清洗管路及進(jìn)樣口,1、分析完畢后，先關(guān)檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理機(jī)，再用經(jīng)濾過(guò)和脫氣的適當(dāng)溶劑清洗色譜系統(tǒng)，正相柱一般

7、用正已烷，反相柱如使用過(guò)含鹽流動(dòng)相，則先用水，然后用甲醇-水沖洗，沖洗前先按（4.1.14.1.2）操作，再用分析流速?zèng)_洗，各種沖洗劑一般沖洗1530分鐘，特殊情況應(yīng)延長(zhǎng)沖洗時(shí)間；并且用水沖洗密封圈三次。,15,九、 清洗管路及進(jìn)樣口,2、 沖洗完畢后，逐步降低流速至0，關(guān)泵，進(jìn)樣器也應(yīng)用相應(yīng)溶劑沖洗，可使用進(jìn)樣閥所附專用沖洗接頭。 3 、關(guān)斷電源，作好使用登記，內(nèi)容包括日期、檢品、色譜柱、流動(dòng)相、柱壓，使用小時(shí)數(shù)，儀器完好狀態(tài)等。,16,【特殊情況】：譜流路系統(tǒng)，從泵、進(jìn)樣器、色譜柱、到檢測(cè)器通池，在分析完畢后，均應(yīng)按（5.1）充分沖洗，特別是用過(guò)含鹽流動(dòng)相的，更應(yīng)注意先用水，再用甲醇-水，

8、充分沖洗。,九、 清洗管路及進(jìn)樣口,17,謝謝大家！,18,第二節(jié) 島津LC-10AT型HPLC注意事項(xiàng),19,一、 流動(dòng)相,1、流動(dòng)相應(yīng)選用色譜純?cè)噭⒏呒兯螂p蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過(guò)濾后使用，過(guò)濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍； 2、水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換（一般不超過(guò)2天），防止長(zhǎng)菌變質(zhì)；,20,二、樣品,1、采用過(guò)濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒； 2、用流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱（若為反相柱，則極性比流動(dòng)相大；若為正相柱，則極性比流動(dòng)相小）的溶劑制備樣品溶液，盡量用流動(dòng)相制備樣品液； 3、手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的35倍；,21,三、色譜

9、柱,1、 使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說(shuō)明書，注意適用范圍，如pH值范圍、流動(dòng)相類型等； 2、 使用符合要求的流動(dòng)相； 3、 使用保護(hù)柱； 4、 如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。,22,三、 色譜柱,5、 色譜柱在不使用時(shí)，應(yīng)用甲醇沖洗，取下后緊密封閉兩端保存； 6、 不要高壓沖洗柱子； 7、 不要在高溫下長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱； 使用過(guò)程中注意輕拿輕放。,23,四、操作過(guò)程,1、 開機(jī)操作： （1）、打開電源，用Harb相連接時(shí)，注意Harb電源，打開計(jì)算機(jī)，打開Bootp Server（一般啟動(dòng)時(shí)已打開）； （ 2 ）、自

10、上而下打開個(gè)組件電源，Bootp Server里顯示有信號(hào)時(shí)（有六行字符），打開工作站（先打開On line）； （3）、打開沖洗泵頭的10異丙醇溶液的開關(guān)（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準(zhǔn)；,24,四、 操作過(guò)程,（ 4 ）、注意各流動(dòng)相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于最低限會(huì)自動(dòng)停泵，注意洗泵溶液的體積，及時(shí)加液； （ 5 ）、使用過(guò)程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時(shí)正確處理各種突發(fā)事件。,25,四、 操作過(guò)程,2、 先以所用流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)一定時(shí)間（如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動(dòng)相），正式進(jìn)樣分析前30min 左右開啟D燈或W燈，以延

11、長(zhǎng)燈的使用壽命； 3、 建立色譜操作方法，注意保存為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果；,26,四、 操作過(guò)程,4、 使用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液洗凈進(jìn)樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品液清洗進(jìn)樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡； 5、 溶劑瓶中的沙芯過(guò)濾頭容易破碎，在更換流動(dòng)相時(shí)注意保護(hù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過(guò)濾頭變臟或長(zhǎng)菌時(shí)，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；,27,四、操作過(guò)程,6、 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個(gè)管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過(guò)程中關(guān)閉D燈、W燈； 7、 關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)閉泵、檢測(cè)器

12、等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機(jī)，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組件，關(guān)閉洗泵溶液的開關(guān)；,28,四、操作過(guò)程,8、 使用者須認(rèn)真履行儀器使用登記制度，出現(xiàn)問題及時(shí)向老師報(bào)告，不要擅自拆卸儀器。未經(jīng)操作培訓(xùn)，不得擅自使用儀器。,29,自己總結(jié)的12條注意事項(xiàng),以下12條注意事項(xiàng)是自己在安裝和使用液相色譜儀中的經(jīng)驗(yàn)得出的，可能存在某些片面性，如有不當(dāng)之處請(qǐng)多提寶貴建議。,30,1、流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過(guò)濾)。 2、流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。,31,3、不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵

13、不進(jìn)液。 4、使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿 外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。,32,5.長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，因?yàn)榧兯组L(zhǎng)霉。 6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑(如甲醇)等清洗進(jìn)樣器。,33,7.C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。 8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱混合器中的過(guò)濾器管路過(guò)濾器單向閥檢查 并清洗。 清洗方法：以異丙醇作溶劑沖洗；放在異丙醇中間用超聲波清 洗；用10稀硝酸清

14、洗。,。,34,9.氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。 10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相 的清洗。,35,11.要注意柱子的PH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。 12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊清洗，然后插入新的 流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。,36,謝謝大家！,37,第三節(jié) 高效液相色譜中常遇見的問題及處理方法,38,一、 保留時(shí)間變化,1.柱溫變化 2.等度與梯度間未能充分平衡 3.緩沖液容量不夠 4.柱污染 5.柱內(nèi)條件變化 6.柱快達(dá)到壽命,1.柱恒溫 2

15、.至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱 3.用25mmol/L的緩沖液 4.每天沖洗柱 5.穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相 6.采用保護(hù)柱,39,二、 保留時(shí)間縮短,1.流速增加 2.樣品超載 3.鍵合相流失 4.流動(dòng)相組成變化 5.溫度增加,1.檢查泵,重新設(shè)定流速 2.降低樣品量 3.流動(dòng)相PH值保持在37.5檢查柱的方向 4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀 5.柱恒溫,40,三、 保留時(shí)間延長(zhǎng),1.流速下降 2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化 3.鍵合相流失 4.流動(dòng)相組成變化 5.溫度降低,1.管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡 2.用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱 3.流動(dòng)相PH值保持在37.5檢查柱

16、的方向 4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀 5.柱恒溫,41,四、 出現(xiàn)肩峰或分叉,1.樣品體積過(guò)大 2.樣品溶劑過(guò)強(qiáng) 3.柱塌陷或形成短路通道 4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效 5.進(jìn)樣器損壞,1.用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% 2.采用較弱的樣品溶劑 3.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件 4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器,過(guò)濾樣品 5.更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子,42,五、 鬼峰,1.進(jìn)樣閥殘余峰 2.樣品中未知物 3.柱未平衡 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜) 5.水污染(反相),1.每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗 2.處理樣品 3.重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑 (尤其是離子對(duì)色譜) 4.每

17、天新配,用抗氧化劑 5.通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水,43,六、 基線噪聲,1.氣泡(尖銳峰) 2.污染(隨機(jī)噪聲) 3.檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲 4.電干擾(偶然噪聲) 5.檢測(cè)器中有氣泡,1.流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓 2.清洗柱,凈化樣品,用HPLC級(jí)試劑 3.更換氘燈 4.采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來(lái)源(如水浴等) 5.流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓,44,七、 峰拖尾,1.柱超載 2.峰干擾 3.硅羥基作用 4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效 5.柱塌陷或形成短路通道 6.死體積或柱外體積過(guò)大 7.柱效下降,1.降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相 2.清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相 3.加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,鈍化樣品 4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器,過(guò)濾樣品 5.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件 6.連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管 7.用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱,45,八、