1、【實驗目的】1. 了解小白鼠睪丸細胞染色體的形態(tài)及數目。2. 初步掌握小白鼠睪丸細胞染色體的玻片標本制作方法。3. 觀察動物細胞染色體的數目和形態(tài)?！緦嶒炘怼咳旧w的制備在原則上可以從所有發(fā)生有絲分裂的組織和細胞懸浮液中得到。最常用的途徑是從骨髓細胞、血淋巴細胞和組織培養(yǎng)的細胞中制備染色體。小型動物的染色體制片最好最有效的材料就是骨髓組織。骨髓細胞中，有絲分裂指數相當高，因此可以直接得到中期細胞而不必象淋巴細胞或其它組織那樣要經過體外培養(yǎng)；對大型動物通常采用對骨骼、脊或胸骨穿刺術吸取紅骨髓，小型動物多采用剝離術取股骨以獲得骨髓細胞。制作染色體標本的先決條件1. 細胞具有旺盛的分裂能力選擇活躍

2、的組織：胸腺，骨髓，睪丸，小腸施加藥物使細胞分裂：PHA2. 設法得到大量的中期細胞：秋水仙素(1) PHA：粗細胞分裂，使淋巴細胞返幼，變?yōu)榱馨湍讣毎?2) 秋水仙素：破壞微管裝配，使紡錘體不能形成，使大量細胞停止在分裂中期。(3) 低滲作用：水進入細胞內，細胞內容空間變大，染色體間的距離拉大，易于染色體展開(4) 空氣干燥：使細胞和染色體展開(5) 固定：用甲醇：冰醋酸=3:1作用使蛋白質變性，對染色體內的組蛋白講，變性后硬度增加，保持了染色體的“及時形態(tài)”，對細胞膜蛋白講，變性使細胞膜硬度增強，形成屏障作用，防止了細胞內物質外溢和丟失。對于小鼠精巢染色體標本的制作，一般包括以下幾個要點:

3、 1. 用一定劑量的秋水仙素破壞紡錘絲的形成，使細胞分裂停滯在中期, 使中期染色體停留在赤道面處; 2. 用低滲法使將細胞膨脹, 以至于在滴片時細胞被脹破, 使細胞的染色體鋪展到載玻片上; 3. 空氣干燥法可使使細胞的染色體在載片上展平, 經Giemsa染色后便可觀察到染色體的顯微圖象?！緦嶒灢牧稀?. 材料：小白鼠。2. 試劑：秋水仙素、0.3%KCl溶液、甲醇、冰醋酸、磷酸緩沖液（pH=6.8）吉姆薩原液。3. 器械：手術刀、手術剪、鑷子、試管架、解剖盤、注射器、針頭、吸管、離心管、離心機、玻片(冰片)、天平、試鏡紙、二甲苯、吸水紙、香柏油、燒杯、水浴鍋?！緦嶒灢襟E】4. 取雄性小鼠以每克

4、體重4ug注射秋水仙素，經14-16小時后，斷頭法殺死小鼠，取出睪丸，用生理鹽水（0.9%的NaCl）吸去血污。5. 放入裝有1ml 0.3% KCl 液的小燒杯中剪碎（呈乳白色）。6. 用銅網過濾到刻度離心管中，再加0.3% KCl 液至4ml。7. 37 靜置30分鐘，進行低滲處理。8. 以800-1000轉/分 離心8分鐘。9. 棄上清液，加入2ml甲醇、冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹氣，輕輕打散細胞，固定8min。10. 再以800-1000轉/分，離心8min。11. 棄上清液，加1ml固定液，制成細胞懸液，固定5min。12. 取潔凈的低溫預冷載玻片，距10-15cm高度滴下2

5、-3滴細胞懸液，從一邊輕輕吹氣，并隨時輕輕敲打，以使細胞均勻分布和促使染色體展開。13. 用濾紙擦去載玻片上多余液體，空氣干燥或文火干燥，染色。14. 用Giesma染色20-30分鐘，細水吸取多余染液，氣干。15. 鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，高倍鏡或油鏡下觀察染色體形態(tài)并計數。附：倒置染色法在玻璃板上用廢舊載玻片作支架，使標本載玻片的標本面向下放置到支架上，在玻璃板和標本載玻片之間滴加Giemsa染液，目的一可以節(jié)省染料，二可以避免染液快速揮發(fā)，三可以防止染色顆粒沉淀，影響觀察，在操作時應注意，多個樣品同時染色應擺放緊密，不要有間隙；滴染液時應盡量滿，不要有氣泡，以免部分

6、染色體不能著色?！緦嶒灲Y果】 圖一 染色體中期（10*40） 圖二 染色體中期未摔開（10*40）圖三 染色體間期（10*40）【實驗結果分析】圖一：此圖接近染色體分裂期的中期，染色體較粗，已發(fā)生固著，但是程度還不夠。在40*10的鏡下看到的染色體應為顆粒狀，隱約能看到顆粒中的分叉。圖二：此圖明顯為染色體的中期，可以清楚地看到從兩級發(fā)出的紡錘絲牽拉染色體到細胞的赤道板。但是細胞膜沒有摔破，無法確認染色體的個數。圖三：此圖為染色體的分裂間期或分裂期前期，染色體還較細，呈絲狀。 【反思與總結】 本次實驗我們一共做了三只小鼠，但最終的結果還是不夠理想。第一只小鼠的注射時間為21個小時左右，實驗操作時

7、在第一次進行低滲時，我們實際加入的是等滲溶液，發(fā)現后立即加入水降低溶液的滲透壓，而且又補了一些低滲液，等離心，沉降等過程完成后，我們低滲已經超過了規(guī)定時間。經過觀察，發(fā)現中期的細胞較少，而且很多細胞堆疊在一起，沒有摔開。 第二只小鼠全過程都是按照實驗步驟規(guī)范地操作，由于第一次的許多細胞沒有摔開，我們就將滴片的高度增加到1.8m。經過觀察，我們和第一次的結果做比較發(fā)現：雖然本次細胞摔得較散，但是摔開的細胞形態(tài)并沒有第一的效果好，初次之外，中期的細胞較少，絕大部分的細胞處于分裂間期。 經過比較兩次的實驗結果與實驗步驟，我們歸納出了一下幾個需要注意的地方：1. 兩次制得的片中中期的細胞都比較少，說明

8、秋水仙素的作用效果不明顯，我們懷疑：秋水仙素在小鼠體內一定時間后，可能會被機體代謝，停滯在中期的細胞可能會在細胞信號分子的誘導下發(fā)生凋亡或著將細胞中的秋水仙素代謝出去，恢復正常狀態(tài)，所以我們認為注射秋水仙素的時間不是越長越好。我們通過查文獻，看到注射實驗為4-6個小時，決定將第三只老鼠的注射時間控制在這個范圍內。2. 第一次的細胞雖然摔得沒有第二次的細胞好，但是第一次細胞的形態(tài)要比第二次好許多。我們認為這與低滲這一步有很大的關系。第一次我們做的低滲時間較長，使細胞已經膨脹到了一定程度，效果較好。第二次的時間較短，低滲不充分，因此應該適當地延長低滲時間。不過，據其他的實驗組所說，低滲時間過長可能

9、導致細胞在滴片之前裂解，在觀察的時候視野中都是雜亂、散落的染色體。除此之外，低滲的溫度也很重要，之前低滲的時候，所取的低滲液，用滴管吹細胞時均沒有進行恒溫，在第三次實驗時我們要做到全方位的恒溫，在低滲和用固定之前，先把低滲液和固定液放入恒溫水中。3. 用銅網過濾的時候我們發(fā)現，若只是將銅網平鋪在試管上，則傾倒液體時，液體很容易沿著試管壁流出。改進的辦法是：將銅網覆蓋在試管上時，用拇指壓一下銅網，使其形成一個凹槽，將液體倒人凹槽中，讓其慢慢地過濾，液面不要超過試管的高度，防止外溢。4. 用剪刀剪小鼠的睪丸，吸管吹氣打散細胞的時候要盡可能地仔細，使組織或細胞盡可能分散，體積盡可能小。這樣過濾得到的

10、液體就比較充裕，離心后，最終制得的細胞懸液也比較多，細胞的密度也較大。5. 第二次摔細胞的高度明顯比第一次的高度高，所得的細胞較分散，這點應該堅持。6. 設備也很重要，我們在觀察之前需要找一個好的顯微鏡。經過一番總結后我們制定出一套新的實驗方案準備在第三只老鼠身上進行實踐，其中有一下幾個要點：（1）秋水仙素：注射量，處理時間，自己配置秋水仙素（事先）（2）解剖小鼠取睪丸減少附帶組織，并用生理鹽水沖洗干凈，附帶血污影響觀察。剪刀切碎是要徹底，增多分離出來的細胞（3）低滲液的量可以稍多一些。低滲時間應掌握準確，低滲液預熱 全程恒溫處理 （隨時滴片觀察細胞形態(tài)，確定低滲終點。）低滲后的細胞吹打時動作

11、要輕（4）恒溫水浴箱的溫度計不太靈敏，用自己的溫度計（5）固定液的量以及固定的時間（6）離心速度不能高于 1000 r/min，離心之后用氣泡法吹散細胞時要適當延長時間（7）摔細胞的高度（8）用質量好的顯微鏡“Z”字型仔細觀察我們在做第三只小鼠的時候，先注射了1.5ml的秋水仙素，但是經過了84個小時后，小鼠仍沒有死亡，估計秋水仙素的作用已經消失。我們再一次注射前，自己配置了秋水仙素。從冰柜里取出了250mg的秋水仙素，進過一個植物實驗室學姐的指導，我們來到了三樓用電子天平精確稱出了秋水仙素10.0mg加入到烘干的試劑瓶中，配置0.1mg/ml的秋水仙素溶液。我們于中午1：30給小鼠注射了配置的秋水仙素，到下午7：00的時候我們來到實驗室，準備殺