1、薄層色譜法thin-layer chromatographyTLC,薄層色譜法,把吸附劑均勻地鋪在一塊光潔的玻璃板或其他薄板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離分析的方法。 特點(diǎn)：1.設(shè)備簡單，操作方便。 2.分離的組份可保存在薄板上。 3.對試樣凈化要求低，試樣間相互 無交叉污染。,第一節(jié)薄層色譜法的原理,薄層色譜法按固定相的性質(zhì)和分離機(jī)理分為：吸附薄層色譜法，分配薄層色譜法，離子交換薄層色譜法，凝膠薄層色譜法。 吸附薄層色譜法：以吸附 劑為固定相，溶劑為流動相（又為展開劑）的液相色譜法。 分離機(jī)理：在薄層的一端點(diǎn)上試樣溶液，然后把薄層的下端浸入合適的溶劑中，借助毛細(xì)管作用使溶劑上升。此時(shí)試樣

2、組分不斷地被吸附，又被溶劑溶解解吸，如此隨之向前移動，這一過程為展開。,由于吸附劑對不同組份有不同的吸附能力，展開劑也有不同的解吸能力，因此在流動相向前流動的過程中，不同組分移動的距離不同，從而得到分離。,比移值示意圖,溶劑前沿,起始線,a,b,c,A,B,比移值：表示各組分在薄 層板上的位置，是定性的參數(shù)。Rf =原點(diǎn)至組分斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到流動相前沿的距離比移值與容量因子和分配系數(shù)的關(guān)系：為反比關(guān)系Rf 值在01之間，合適的Rf 值為0.20.8，最佳Rf 值為0.40.5,相對比移值：將試樣與參照物同時(shí)展開，可消除一些系統(tǒng)誤差，用于定性結(jié)果準(zhǔn)確。Rst=原點(diǎn)到組份斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)

3、到參照物斑點(diǎn)中心的距離若A為試樣，B為參照物， Rst= a/b 注意：Rst 1或Rst 1 分離度：R=2 d/w1+w2 d兩組分斑點(diǎn)中心距離 w1、w2分別為兩斑點(diǎn)寬度R 1為兩組分斑點(diǎn)分離的標(biāo)志,固定相,TLC對固定相的要求； 1、表面積要大， 2、在展開劑中不溶， 3、具有可逆的吸附性， 4、便于觀察分離結(jié)果。 固定相的選擇： 根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)來選擇合適的固定相 對于強(qiáng)極性試樣，應(yīng)用活性低的吸附劑； 對于弱極性試樣，應(yīng)用活性高的吸附劑。,分離親脂性化合物常選擇氧化鋁、硅膠等。 分離親水性化合物常選擇纖維素、離子交換樹脂、硅藻土及聚酰胺等。 注意：吸附劑的酸堿性應(yīng)與試樣保持一致

4、，以防止吸附劑與試樣組份發(fā)生酸堿反應(yīng)而產(chǎn)生不可逆吸附。,流動相（展示劑）,選擇合適的流動相是TLC離的關(guān)鍵。 要求： 1、能使待測組份很好地溶解，不與組份發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 2、使展開的斑點(diǎn)園而集中，無拖尾現(xiàn)象。 3、使待測組份的Rf 值最好在0.4-0.5之間，各組份Rf 應(yīng)大于0.05，以便完全分離。,流動相的選擇原則：相似性原則。 通過實(shí)驗(yàn)找出最佳分離的展開劑。 實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先用單一的低極性溶劑展開，后再更換極性大的溶劑。 用單一溶劑不能分離時(shí)，可用兩種或兩種以上的混合展開劑。 常用單一溶劑的極性順序：已烷（石油醚）二硫化碳 苯 四氯化碳 二氯甲烷 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 丙醇 甲醇 水,常用的

5、混合展開劑：水乙醇，水甲醇，水丁酮甲醇，水乙醇丁酮乙酰丙酮等。注意：混合溶劑臨用時(shí)新配，以免時(shí)間貯存，因相互作用而變質(zhì)。為了找到最佳溶劑系統(tǒng)，可采用三角形優(yōu)化法。,三角形優(yōu)化法,固定相,活性級別,待測物,極性,極性,展開劑,V,I,注：活性級別越小，吸附力越大,強(qiáng),強(qiáng),薄層色譜法的基本技術(shù),步驟：制板、點(diǎn)樣、展開、顯色定位、定性、 定量。 制板：軟板：用硅膠H（不加粘合劑） 硬板：用硅膠G（加粘合劑煅石膏） 用硅膠CMC（加粘合劑羧甲基纖維素） 用硅膠F254（加熒光劑） 要求：吸附劑涂鋪均勻，表面光滑，厚度一致。 注意：涂鋪后的薄板應(yīng)水平放置，室溫晾干，干燥活化。（活化溫度、時(shí)間可根據(jù)活性要

6、求變化。硅膠G板在110烘干1小時(shí)。）,點(diǎn)樣,試樣溶于適當(dāng)溶劑中，盡量避免用水。常用乙醇、甲醇配備，試樣溶液濃度為0.01%-0.1%。 點(diǎn)樣用管口平整的毛細(xì)管或平頭微量注射器。 試樣溶液點(diǎn)在距薄層底邊約2cm處，點(diǎn)樣直徑不超過5mm，點(diǎn)間距為1-1.5cm。,1、點(diǎn)樣應(yīng)在干燥的條件下完成，點(diǎn)樣時(shí)間不超過10分鐘。 2、點(diǎn)樣時(shí)要原點(diǎn)的直徑一致，點(diǎn)間距要精確，以確保定量分析的準(zhǔn)確性。 3、點(diǎn)樣時(shí)宜分次點(diǎn)樣，每次點(diǎn)樣后必須干燥后再點(diǎn)第二次。 4、若試樣中欲測成份含量太低或含有的雜質(zhì)使展開后的背景太深時(shí)應(yīng)進(jìn)行萃取分離或點(diǎn)樣前的衍生化處理。,注意,展開,點(diǎn)樣后的薄層板要置于密閉的玻璃層析槽中用合適的展

7、開劑展開。 展開方式： 軟板只能進(jìn)行水平展開。 硬板可采用近水平、上行、下行、雙向、多次展開。,注意,1、點(diǎn)樣處不能浸入展開劑中。 2、展開距離一般為10-15cm，取出薄層板在前沿作記號。 3、展開過程中要恒溫恒濕。 4、當(dāng)使用極性相差較大的多組份混合展開劑時(shí)，要防止邊緣效應(yīng)。,邊緣效應(yīng),邊緣效應(yīng)：薄層邊緣處由于展開劑中非極性成份較易揮發(fā)而使比移值比薄層中間部位增大的現(xiàn)象。 產(chǎn)生原因：展開槽內(nèi)溶劑蒸氣未達(dá)飽和，造成展開劑的蒸發(fā)速度在薄板兩邊與在中間部分不等。展開劑中極性較弱和沸點(diǎn)較低的溶劑在邊緣揮發(fā)得快，致使邊緣部分的展開劑中極性溶劑比例增大，故比移值相對較大。,顯色定位,1、光學(xué)檢出法 2

8、、蒸氣顯色法 3、試劑顯色法,定性,用試樣與標(biāo)準(zhǔn)對照定性，常用的方法： 1、用斑點(diǎn)的比移值或相對比移值。 2、用斑點(diǎn)的顯色特性。 3、斑點(diǎn)原位掃描。 4、與其他方法聯(lián)用。 注意：用比移值定性時(shí)，最好將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在同一塊板上，用兩種以上不同組份的展開劑展開。,定量,1、目視法 2、面積測量法 3、斑點(diǎn)洗脫法 4、用薄層掃層描儀：是用一束長寬可以調(diào)節(jié)的一定波長一定強(qiáng)度的光照射到薄層斑點(diǎn)上，進(jìn)行整個(gè)斑點(diǎn)掃描，通過測量斑點(diǎn)光束強(qiáng)度的變化達(dá)到定量的目的。 根據(jù)測量方式可分為吸收測定法和熒光法。 根據(jù)掃描方式可分為線性掃描和鋸齒掃描。,薄 層 掃 描 圖,光 束,薄層掃描儀吸收測定圖示,光源,檢測器,薄

9、層板,高效薄層色譜法high performance thin-layer chromatographyHPTLC,高效薄層色譜法,HPTLC是在普通TLC基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種更為靈敏、高效、快速、精密、準(zhǔn)確的薄層技術(shù)。 HPTLC采用了小顆粒吸附劑制備均勻薄層，分離效率比TLC提高了數(shù)倍，分析時(shí)間也縮短了。 HPTLC所用高效薄層板的商品化和點(diǎn)樣、展開、顯色、定量等一系列操作向儀器化的發(fā)展，大提高了該法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。 HPTLC廣泛用于體液及組織中藥物及其代謝產(chǎn)物的含量測定。,紙色譜paper chromatographyPC,紙色譜法,紙色譜法是以濾紙為載體的色譜方法。 固定相：載體濾紙 固定液濾紙吸取的水份 流動相：有機(jī)溶劑 分離原理屬于正相分配色譜法 被測組份在固定相和流動相之間進(jìn)行分配時(shí)，由于各組份分配系數(shù)的不同得到分離。 分配系數(shù)的大小直接與化合物的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。 化合物極性大或親水性強(qiáng)，則分配系數(shù)大，比移值??；化合物極性小或親脂性強(qiáng)則分配系數(shù)小，比移值大。,操作,紙色譜的操作與薄層色譜法相似，有濾紙的準(zhǔn)備、點(diǎn)樣、展開、顯色、定性、定量。 注意： 1、濾紙要用色譜紙。要根據(jù)分離的對象和分離分析的目的選擇濾紙型號。 2、展開劑應(yīng)預(yù)先用水飽和，防止固定液遺失。常用水飽和的丁醇、正戊醇、酚