1、1,第三章 工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基,2,發(fā)酵生產(chǎn)的一般流程,菌種,培養(yǎng)基,過濾,下游 提取,擴(kuò)大 培養(yǎng),產(chǎn)品,空氣,滅菌,3,培養(yǎng)基組成對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量、產(chǎn)品的分離精制都有重要的影響。,4,1、按培養(yǎng)基成分,1）合成培養(yǎng)基, 所用原料的化學(xué)成分明確、穩(wěn)定 如葡萄糖、硫酸銨 用于實(shí)驗(yàn)室范圍作有關(guān)營(yíng)養(yǎng)、代謝、分類鑒定、 選育菌種、遺傳分析定量研究工作；在生產(chǎn)某些疫苗的過程中，為了防止其他蛋白質(zhì)等雜質(zhì)摻入，也常用合成培養(yǎng)基； 營(yíng)養(yǎng)單一、價(jià)格較高，不適于大規(guī)模生產(chǎn),2）天然培養(yǎng)基,原料是一些天然動(dòng)、植物產(chǎn)品 如花生餅粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、玉米漿等 來源廣泛（大多為

2、農(nóng)副產(chǎn)品）、營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)格低廉、適于工業(yè)化生產(chǎn) 一般不需要另加微量元素、維生素等物質(zhì) 由于成分復(fù)雜，不易重復(fù)，如對(duì)原料質(zhì)量等方面不加控制會(huì)影響生產(chǎn)穩(wěn)定性,3）半合成培養(yǎng)基,既含天然成分，又含純化學(xué)試劑 發(fā)酵工業(yè)中使用的培養(yǎng)基絕大多數(shù)是半合成培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的分類,5,2、按物理狀態(tài)分,1）固體, 適于菌種和孢子的培養(yǎng)與保存，傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)，也廣泛應(yīng)用于有子實(shí)體的真菌類，如香菇、木耳等的生產(chǎn)； 近年來由于機(jī)械化程度的提高，在發(fā)酵工業(yè)上又開始應(yīng)用固體培養(yǎng)基進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，其組分常用麩皮、大米、小米、木屑、禾殼等。,2）半固體, 瓊脂0.5%-0.8% 主用于鑒定細(xì)菌、觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)特征及噬菌體的效

3、價(jià)測(cè)定等,3）液體,發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基,6,發(fā)酵培養(yǎng)基的成分、作用及來源,培養(yǎng)基通常都含有微生物生長(zhǎng)繁殖所必須得碳源（能源）、氮源、無(wú)機(jī)鹽及微量元素、生長(zhǎng)因子和水等營(yíng)養(yǎng)成分。有些還含有前體、產(chǎn)物促進(jìn)劑、誘導(dǎo)劑和抑制劑等。,水、氧、螯合劑、緩沖劑、消泡劑等,7,一、碳源,凡是作為微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)或者代謝產(chǎn)物中碳架來源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，都稱為碳源。 主要功能： 1）為菌體的生長(zhǎng)繁殖提供能源和合成菌體所必需的成分； 2）為合成目的產(chǎn)物提供所需的碳元素成分。,一、碳源,常用的碳源:,糖類 油脂 有機(jī)酸 低碳醇等,8,1、糖類, 發(fā)酵培養(yǎng)基中使用最廣泛的碳源; 主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等,工業(yè)上常用

4、的糖類及來源,淀粉水解糖的制備是發(fā)酵生產(chǎn)的一項(xiàng)重要工藝，將在后面詳細(xì)介紹,9,最易利用，幾乎所有微生物都能利用 葡萄糖常作為培養(yǎng)基的一種主要成分。 但過多的葡萄糖會(huì)過分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，抑制微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。,葡萄糖,10,糖蜜 制糖的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物; 含有豐富的糖、氮類化合物、無(wú)機(jī)鹽和維生素等，是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基價(jià)廉物美的碳源; 糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達(dá)45-50%。水分含量：18-36%。粗蛋白質(zhì)含量2.5-8%，粗灰分4%-12.5%。 糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，二者在糖的含量和無(wú)機(jī)鹽的含量上有所不同，即使同一種糖蜜由于加工方法不

5、同其成分也存在差異，因此使用時(shí)要注意。,11,淀粉 多糖，也是常用的碳源; 需經(jīng)胞外酶水解成單糖后再被吸收利用; 使用淀粉可克服葡萄糖代謝過快的弊病，價(jià)格也比較低廉，在發(fā)酵工業(yè)中被普遍使用。 常用的淀粉為玉米、甘薯、馬鈴薯、木薯淀粉。,12, 脂肪也能被許多微生物作為碳源和能源 這些微生物都具有比較活躍的脂肪酶，在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解為甘油和脂肪酸，在溶解氧的參與下，進(jìn)一步氧化成CO2和H2O，并釋放出大量的能量。 當(dāng)微生物利用脂肪作為碳源時(shí)，要供給比糖代謝更多的氧，不然大量的脂肪酸和代謝中的有機(jī)酸會(huì)積累，從而引起pH的下降，并影響微生物細(xì)胞中酶的活力。 常用豆油、菜油、葵花籽油、豬

6、油、魚油、棉籽油等,2、脂肪,13, 隨著石油工業(yè)的發(fā)展，發(fā)酵工業(yè)的碳源也有所擴(kuò)大。 如正烷烴（一般指從石油裂解中得到的14-18碳的直鏈烷烴混合物）已用于有機(jī)酸、氨基酸、維生素、抗生素和酶制劑的工業(yè)發(fā)酵中。,3、烴和醇類,4、有機(jī)酸,一些微生物對(duì)許多有機(jī)酸（如乳酸、檸檬酸、乙酸等）有很強(qiáng)的氧化能力。因此有機(jī)酸或它們的鹽也能作為微生物的碳源。,有機(jī)酸的利用常會(huì)使pH值上升。,14,影響碳源選擇的因素有哪些？,1、碳源的代謝速率,2、價(jià)格,3、純度：,4、培養(yǎng)基的配制方法，尤其是滅菌方法。,5、政府的政策和法規(guī)。,15,二、氮源,有機(jī)氮源 豆餅（粕）粉、花生餅粉、棉籽餅粉、魚粉、蠶蛹粉、酵母粉、

7、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、廢菌絲體、酒糟、尿素等,無(wú)機(jī)氮源 氨水、銨鹽、硝酸鹽等,16,氮源物質(zhì)常對(duì)培養(yǎng)液pH產(chǎn)生影響 (NH4)SO4 2NH3 + H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 在常用的無(wú)機(jī)氮中，硫酸銨被菌體利用后會(huì)使培養(yǎng)液的pH下降，為生理酸性物質(zhì)； 硝酸鈉被同化時(shí)則引起培養(yǎng)液pH上升，為生理堿性物質(zhì),如何合理使用生理酸堿性物質(zhì)？,17,氨水,1、氨水使用的普遍性及其作用。 紅霉素 ；鏈霉素,2、局部過堿及解決方案。,3、嗜堿性微生物的污染及防治。,18,無(wú)機(jī)氮源和尿素、玉米漿等可被迅速利用，為速效氮。 蛋白質(zhì)氮?jiǎng)t需先水解成肽和氨基酸后才能被吸

8、收利用，屬遲效氮。,19,三、生長(zhǎng)因子,概念：微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)。,類別：維生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍生物,不是所有微生物都必需的，只是對(duì)于某些自己不能合成這些成分的微生物才是必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。,如以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌為生物素缺陷型，以生物素為生長(zhǎng)因子。,20,提供生長(zhǎng)因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料,1）玉米漿（ corn steep liquor, CSL）, 用亞硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的濃縮液，也是玉米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)品, 雖然主要用作氮源，但它含有豐富的氨基酸、核酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等，常用作為提供生長(zhǎng)因子的物質(zhì)。,21,2）麩皮水解液,可代替玉米漿，蛋白質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成

9、分比玉米漿少。,用量一般為1%（以干麩皮計(jì)）左右,水解條件： 以干麩皮：水：HCl=4.6:26:1配比混合，裝入水解鍋中以0.070.08MPa表壓加熱水解7080min。 以干麩皮：水=1：20，用鹽酸調(diào)pH值1.0，以0.25MPa表壓加熱水解20min。然后過濾取濾液。,22,3）糖蜜（molasses）, 甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米漿，但氨基酸等有機(jī)氮含量較低,4) 酵母,酵母膏、酵母浸出液、酵母粉,5）其他,牛肉膏、蛋白胨、動(dòng)物心、肝等組織浸液等都含有豐富的生長(zhǎng)因子,23,四、水,1）是微生物機(jī)體的重要組成部分 2）進(jìn)行代謝反應(yīng)的介質(zhì) 3）營(yíng)養(yǎng)物、代謝物、氧氣等必須溶解于水后才

10、能通過細(xì)胞表面進(jìn)行正常的活動(dòng)； 4）水的比熱高，能有效吸收代謝過程中放出的熱，使細(xì)胞內(nèi)溫度不致驟然上升；同時(shí)水又是熱的良導(dǎo)體，有利于散熱，可調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度。,24,對(duì)于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關(guān)重要的，因?yàn)樵诓煌粗写嬖诘母鞣N因素對(duì)微生物發(fā)酵代謝影響甚大，特別是水中的礦物質(zhì)組成對(duì)釀酒工業(yè)影響甚大。 水源質(zhì)量的主要參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。 對(duì)于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水，生產(chǎn)中使用的水有深井水、自來水、地表水等。,25,五、無(wú)機(jī)鹽和微量元素,主要無(wú)機(jī)元素：磷、硫、鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等。 微量無(wú)機(jī)元素：鉬、鋅、鈷、銅、硼、溴等。微

11、量無(wú)機(jī)元素需求量很少，但往往會(huì)強(qiáng)烈刺激微生物的生長(zhǎng)發(fā)育。,26, 磷酸鹽,磷是某些蛋白質(zhì)和核酸的組成成分 磷酸鹽在培養(yǎng)基中還具有緩沖作用 微生物對(duì)磷的需要量一般為0.0050.01mol/L 常用K3PO4、Na2HPO4 、NaH2PO4, 硫酸鎂,Mg 2+是許多重要酶（如己糖磷酸化酶、異檸檬酸脫氫酶、羧化酶等）的激活劑 鎂離子能提高一些氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生菌對(duì)自身所產(chǎn)的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、鏈霉素、新生霉素等產(chǎn)生菌。 硫存在于細(xì)胞的蛋白質(zhì)中，是含硫氨基酸的組成成分 硫是構(gòu)成一些酶的活性基團(tuán) 硫酸鎂加入培養(yǎng)基中，在堿性條件下會(huì)形成氫氧化鎂沉淀，配料時(shí)要注意。, 鉀鹽,鉀不參與細(xì)胞結(jié)

12、構(gòu)物質(zhì)的組成 是許多酶的激活劑 菌體生長(zhǎng)所需鉀量約為0.1g/L(以K2SO4計(jì)), 微量元素,需量微少，但又不可缺少 一般作為碳、氮源的農(nóng)副產(chǎn)物天然原料中，本身含有，不必另加 某些金屬離子，特別是汞離子和銅離子，具有明顯的毒性,27,六、前體 (precursor),概念： 指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而又較大的提高。,28,發(fā)現(xiàn)： 最早是從青霉素的生產(chǎn)中被發(fā)現(xiàn)的。 加入玉米漿后，青霉素單位可從20U/ml增加到100U/ml； 玉米漿中含有苯乙胺，它能被優(yōu)先合成到青霉素分子中，從而

13、提高青霉素G的產(chǎn)量。,青霉素G,苯乙胺,29,大多數(shù)前體，例如苯乙胺對(duì)微生物的生長(zhǎng)有毒性，以及菌體具有將前體氧化分解的能力，因此在生產(chǎn)中為了減少毒性和增加前體的利用率，常采用少量多次的流加工藝。 苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%。,30,31,七、促進(jìn)劑和抑制劑,1、促進(jìn)劑： 促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。,32,各種促進(jìn)劑對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用,33, 促進(jìn)劑不是前體或營(yíng)養(yǎng)物 可影響正常代謝，或促進(jìn)中間代謝產(chǎn)物的積累，或提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,例如 巴比妥可增加鏈霉素產(chǎn)生菌的抗自溶能力，推遲自溶時(shí)間，增加鏈霉素積累。,34, 促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的

14、機(jī)制:, 各種促進(jìn)劑的效果除受菌種、菌齡的影響外，還與所用的培養(yǎng)基組成有關(guān)，即使是同一種促進(jìn)劑，用同一菌株，生產(chǎn)同一產(chǎn)物，在使用不同的培養(yǎng)基時(shí)效果也會(huì)不一樣。,如在酶制劑生產(chǎn)中，有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物； 有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶的分泌與生產(chǎn)， 也有人認(rèn)為表面活性劑對(duì)酶的表面失活有保護(hù)作用； 有些促進(jìn)劑的作用是沉淀或鰲合有害的金屬離子。,35,2、抑制劑 抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)刺激另一代謝途徑，以致可以改變微生物的代謝途徑。,如酵母厭氧發(fā)酵中加入亞硫酸鹽或堿類，可以使酒精發(fā)酵受到抑制，而轉(zhuǎn)入甘油發(fā)酵,36,某些代謝產(chǎn)物的抑制劑,37,發(fā)酵培

15、養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與優(yōu)化,38,設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基的四個(gè)要求：,1目的明確 2營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào) 3條件適宜 4經(jīng)濟(jì)節(jié)約,39,1目的明確,首先要明確配制該培養(yǎng)基的目的 實(shí)驗(yàn)室研究，不必過多計(jì)較成本 大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn) 種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基 主流代謝產(chǎn)物 一般指通過主要代謝途徑產(chǎn)生的那些結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單、產(chǎn)量較高、價(jià)值較低的降解產(chǎn)物 次級(jí)代謝產(chǎn)物 一般是指通過復(fù)雜合成途徑產(chǎn)生的那些結(jié)構(gòu)復(fù)雜、產(chǎn)量低、價(jià)值高的合成產(chǎn)物,40, 一般只有小分子能夠通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝； 微生物能夠利用復(fù)雜的大分子是由于分泌各種水解酶，在體外將大分子水解為微生物能直接利用的小分子; 微生物來源和種類不同，所分泌的水解酶系不同； 有的微生

16、物由于水解酶系的缺乏，只能利用簡(jiǎn)單物質(zhì)；,在考慮某一菌種對(duì)培養(yǎng)基的總體要求時(shí)，在成分選擇時(shí)應(yīng)注意菌體的同化能力,41,在碳源和氮源的選取時(shí)特別要注意，許多碳源和氮源都是復(fù)雜的有機(jī)大分子，如淀粉、黃豆餅粉等；用這類原料，微生物須具備分泌胞外淀粉酶和蛋白酶。, 培養(yǎng)不能分泌淀粉酶的菌株，可先將淀粉糖化, 有些微生物，如大多數(shù)氨基酸產(chǎn)生菌，缺乏蛋白水解酶，可先將有機(jī)氮源水解 豆餅水解液制備方法 ： 豆餅粉（100kg） + 水 (133kg) + 鹽酸，調(diào)pH1.0以下，100C，常壓水解16h，或0.25-0.3MPa壓力水解6h，也可用硫酸水解，用氨中和。,42,2營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào),在大多數(shù)異養(yǎng)菌的培養(yǎng)

17、基中，各營(yíng)養(yǎng)要素在量上的比例大體符合以下十倍序列的遞減規(guī)律： 要素： H2OC+能源N源P、SK、Mg生長(zhǎng)因子 含量： (10-1)(10-2)(10-3)(10-4) (10-5)(10-6),6,43,不同生長(zhǎng)階段，對(duì)碳氮比的最適要求可能不同。一般來講，因?yàn)樘荚醇茸鳛樘技軈⑴c菌體和產(chǎn)物的合成，又作為生命過程中的能源，故比例要求比氮源高。 一般工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比為100:(0.2-2.0）;但在谷氨酸發(fā)酵中因產(chǎn)物含氮量較高，所以氮源比例相對(duì)高些，一般取100:(15-20）。如碳氮比為100:(0.5-2.0），則只長(zhǎng)菌體而不合成谷氨酸。,培養(yǎng)基成分選擇的原則(continued),合適

18、的碳氮比, 碳氮比對(duì)生長(zhǎng)繁殖以及產(chǎn)物合成的影響極其顯著 氮源過多，會(huì)使菌體生長(zhǎng)過旺，pH偏高，不利代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影響產(chǎn)量； 碳源過多則易形成較低的pH；碳源不足則容易引起菌體的衰老和自溶。,碳氮比也隨碳源及氮源的種類以及通氣攪拌等條件而異。,44,碳氮比（CN比）,五種常用氮源的含氮量 NH3(82)CO(NH2)2(46)NH4NO3(35)(NH4)2CO3(29.2)(NH4)2SO4(21) 普通培養(yǎng)基的CN比為1000.52 谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基為1001121 放線菌產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基為1001020 碳氮比(C/N)一般指培養(yǎng)基中元素C與N的比值。為方便測(cè)

19、定和計(jì)算，人們常以培養(yǎng)基中還原糖含量與粗蛋白含量的比值來表示。,45,對(duì)于生產(chǎn)氨基酸等含氮的化合物時(shí)，它的發(fā)酵培養(yǎng)基除供給充足的碳源物質(zhì)外，還應(yīng)該添加足夠的銨鹽或尿素等氮素化合物。 發(fā)酵培養(yǎng)基的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度應(yīng)盡可能高些，這樣在同等或相近的轉(zhuǎn)化率條件下有利于提高單位容積發(fā)酵罐的利用率，增加經(jīng)濟(jì)效益。 發(fā)酵培養(yǎng)基需耗用大量原料，因此，原料來源、原材料的質(zhì)量以及價(jià)格等必須予以重視。,46,在設(shè)計(jì)營(yíng)養(yǎng)物配比時(shí)，還應(yīng)該考慮避免培養(yǎng)基中各成分之間的相互作用。如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸鹽時(shí)，會(huì)與培養(yǎng)基中鈣或鎂離子在加熱時(shí)發(fā)生沉淀反應(yīng)。在高溫下，還原糖與蛋白質(zhì)或氨基酸也會(huì)相互作用產(chǎn)生褐色物質(zhì)。 在培養(yǎng)基

20、配制時(shí)，可添加化學(xué)試劑補(bǔ)充宏量元素。其中，首選的是K2HPO4和MgSO4，因?yàn)樗鼈儼怂姆N元素。對(duì)于微量元素，一般化學(xué)試劑、水及器皿上均有存在。,47,3條件適宜,48,pH是微生物生長(zhǎng)和代謝的極為重要的環(huán)境因子； 最適pH 細(xì)菌pH 7.08.0放線菌pH 7.58.5 酵母菌pH 3.86.0霉菌pH 4.05.8 微生物在利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，由于酸堿物質(zhì)的積累或代謝酸堿物質(zhì)的形成，會(huì)造成培養(yǎng)體系中pH的波動(dòng)；,（1） pH的要求,49,要保證發(fā)酵過程中pH能滿足工藝的要求，合理配制培養(yǎng)基是決定因素，因而在配制培養(yǎng)基選取營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，除了考慮營(yíng)養(yǎng)需求外，也要考慮其代謝后對(duì)培養(yǎng)體系pH緩沖能力的影響。不少微生物有很強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，如不適當(dāng)?shù)丶右哉{(diào)節(jié)，就會(huì)抑制甚至殺死其自身。,50,pH調(diào)節(jié) 內(nèi)源調(diào)節(jié)： 1）磷酸鹽緩沖液； 調(diào)節(jié)K2HPO4和KH2PO4兩者