1、口蹄疫防治技術(shù)規(guī)范口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒引起的以偶蹄動(dòng)物為主的急性、熱性、高度傳染性疫病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，我國(guó)規(guī)定為一類動(dòng)物疫病。為預(yù)防、控制和撲滅口蹄疫，依據(jù)中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法、重大動(dòng)物疫情應(yīng)急條例、國(guó)家突發(fā)重大動(dòng)物疫情應(yīng)急預(yù)案等法律法規(guī)，制定本技術(shù)規(guī)范。1 適用范圍本規(guī)范規(guī)定了口蹄疫疫情確認(rèn)、疫情處置、疫情監(jiān)測(cè)、免疫、檢疫監(jiān)督的操作程序、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及保障措施。本規(guī)范適用于中華人民共和國(guó)境內(nèi)一切與口蹄疫防治活動(dòng)有關(guān)的單位和個(gè)人。2 診斷2.1 診斷指標(biāo)2.1.1 流行病學(xué)特點(diǎn)2.1.1.1 偶

2、蹄動(dòng)物，包括?？苿?dòng)物（牛、瘤牛、水牛、牦牛）、綿羊、山羊、豬及所有野生反芻和豬科動(dòng)物均易感，駝科動(dòng)物（駱駝、單峰駱駝、美洲駝、美洲駱馬）易感性較低。2.1.1.2 傳染源主要為潛伏期感染及臨床發(fā)病動(dòng)物。感染動(dòng)物呼出物、唾液、糞便、尿液、乳、精液及肉和副產(chǎn)品均可帶毒?？祻?fù)期動(dòng)物可帶毒。2.1.1.3 易感動(dòng)物可通過(guò)呼吸道、消化道、生殖道和傷口感染病毒，通常以直接或間接接觸（飛沫等）方式傳播，或通過(guò)人或犬、蠅、蜱、鳥(niǎo)等動(dòng)物媒介，或經(jīng)車(chē)輛、器具等被污染物傳播。如果環(huán)境氣候適宜，病毒可隨風(fēng)遠(yuǎn)距離傳播。2.1.2 臨床癥狀2.1.2.1 牛呆立流涎，豬臥地不起，羊跛行；2.1.2.2 唇部、舌面、齒齦、

3、鼻鏡、蹄踵、蹄叉、乳房等部位出現(xiàn)水泡；2.1.2.3 發(fā)病后期，水泡破潰、結(jié)痂，嚴(yán)重者蹄殼脫落，恢復(fù)期可見(jiàn)瘢痕、新生蹄甲；2.1.2.4 傳播速度快，發(fā)病率高；成年動(dòng)物死亡率低，幼畜常突然死亡且死亡率高，仔豬常成窩死亡。2.1.3 病理變化2.1.3.1消化道可見(jiàn)水泡、潰瘍；2.1.3.2幼畜可見(jiàn)骨骼肌、心肌表面出現(xiàn)灰白色條紋，形色酷似虎斑。2.1.4 病原學(xué)檢測(cè)2.1.4.1 間接夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，檢測(cè)陽(yáng)性（ELISA OIE 標(biāo)準(zhǔn)方法 附件一）；2.1.4.2 RT-PCR試驗(yàn)，檢測(cè)陽(yáng)性（采用國(guó)家確認(rèn)的方法）；2.1.4.3 反向間接血凝試驗(yàn)（RIHA），檢測(cè)陽(yáng)性（附件二）；2.1.4

4、.4 病毒分離，鑒定陽(yáng)性。2.1.5 血清學(xué)檢測(cè)2.1.5.1中和試驗(yàn)，抗體陽(yáng)性；2.1.5.2液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，抗體陽(yáng)性；2.1.5.3非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA檢測(cè)感染抗體陽(yáng)性；2.1.5.4 正向間接血凝試驗(yàn)（IHA），抗體陽(yáng)性（附件三）。2.2 結(jié)果判定2.2.1 疑似口蹄疫病例符合該病的流行病學(xué)特點(diǎn)和臨床診斷或病理診斷指標(biāo)之一，即可定為疑似口蹄疫病例。2.2.2 確診口蹄疫病例疑似口蹄疫病例，病原學(xué)檢測(cè)方法任何一項(xiàng)陽(yáng)性，可判定為確診口蹄疫病例；疑似口蹄疫病例，在不能獲得病原學(xué)檢測(cè)樣本的情況下，未免疫家畜血清抗體檢測(cè)陽(yáng)性或免疫家畜非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA檢測(cè)陽(yáng)性，可判定為確診口蹄疫病

5、例。2.3疫情報(bào)告任何單位和個(gè)人發(fā)現(xiàn)家畜上述臨床異常情況的，應(yīng)及時(shí)向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)應(yīng)立即按照有關(guān)規(guī)定赴現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行核實(shí)。2.3.1 疑似疫情的報(bào)告縣級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到報(bào)告后，立即派出2名以上具有相關(guān)資格的防疫人員到現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行臨床和病理診斷。確認(rèn)為疑似口蹄疫疫情的，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)報(bào)告同級(jí)獸醫(yī)行政管理部門(mén)，并逐級(jí)上報(bào)至省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)。省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)在接到報(bào)告后，1小時(shí)內(nèi)向省級(jí)獸醫(yī)行政管理部門(mén)和國(guó)家動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。診斷為疑似口蹄疫病例時(shí)，采集病料（附件四），并將病料送省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)，必要時(shí)送國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室。2.3.2 確診疫情的報(bào)告省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)

6、督機(jī)構(gòu)確診為口蹄疫疫情時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告省級(jí)獸醫(yī)行政管理部門(mén)和國(guó)家動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)；省級(jí)獸醫(yī)管理部門(mén)在1小時(shí)內(nèi)報(bào)省級(jí)人民政府和國(guó)務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門(mén)。國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室確診為口蹄疫疫情時(shí)，應(yīng)立即通知疫情發(fā)生地省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)和獸醫(yī)行政管理部門(mén)，同時(shí)報(bào)國(guó)家動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)和國(guó)務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門(mén)。省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)診斷新血清型口蹄疫疫情時(shí)，將樣本送至國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室。2.4 疫情確認(rèn)國(guó)務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門(mén)根據(jù)省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)或國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室確診結(jié)果，確認(rèn)口蹄疫疫情。3 疫情處置3.1疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)的劃分3.1.1疫點(diǎn) 為發(fā)病畜所在的地點(diǎn)。相對(duì)獨(dú)立的規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)/戶，以病畜所在的

7、養(yǎng)殖場(chǎng)/戶為疫點(diǎn)；散養(yǎng)畜以病畜所在的自然村為疫點(diǎn)；放牧畜以病畜所在的牧場(chǎng)及其活動(dòng)場(chǎng)地為疫點(diǎn)；病畜在運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生疫情，以運(yùn)載病畜的車(chē)、船、飛機(jī)等為疫點(diǎn)；在市場(chǎng)發(fā)生疫情，以病畜所在市場(chǎng)為疫點(diǎn)；在屠宰加工過(guò)程中發(fā)生疫情，以屠宰加工廠（場(chǎng)）為疫點(diǎn)。3.1.2 疫區(qū) 由疫點(diǎn)邊緣向外延伸3公里內(nèi)的區(qū)域。3.1.3 受威脅區(qū) 由疫區(qū)邊緣向外延伸10公里的區(qū)域。在疫區(qū)、受威脅區(qū)劃分時(shí)，應(yīng)考慮所在地的飼養(yǎng)環(huán)境和天然屏障（河流、山脈等）。3.2 疑似疫情的處置對(duì)疫點(diǎn)實(shí)施隔離、監(jiān)控，禁止家畜、畜產(chǎn)品及有關(guān)物品移動(dòng)，并對(duì)其內(nèi)、外環(huán)境實(shí)施嚴(yán)格的消毒措施。必要時(shí)采取封鎖、撲殺等措施。3.3 確診疫情處置疫情確診后，立即

8、啟動(dòng)相應(yīng)級(jí)別的應(yīng)急預(yù)案。3.3.1 封鎖疫情發(fā)生所在地縣級(jí)以上獸醫(yī)行政管理部門(mén)報(bào)請(qǐng)同級(jí)人民政府對(duì)疫區(qū)實(shí)行封鎖，人民政府在接到報(bào)告后，應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)發(fā)布封鎖令?？缧姓^(qū)域發(fā)生疫情的，由共同上級(jí)獸醫(yī)行政管理部門(mén)報(bào)請(qǐng)同級(jí)人民政府對(duì)疫區(qū)發(fā)布封鎖令。3.3.2 對(duì)疫點(diǎn)采取的措施3.3.2.1 撲殺疫點(diǎn)內(nèi)所有病畜及同群易感畜，并對(duì)病死畜、被撲殺畜及其產(chǎn)品進(jìn)行無(wú)害化處理（附件五）；3.3.2.2對(duì)排泄物、被污染飼料、墊料、污水等進(jìn)行無(wú)害化處理（附件六）；3.3.2.3對(duì)被污染或可疑污染的物品、交通工具、用具、畜舍、場(chǎng)地進(jìn)行嚴(yán)格徹底消毒（附件七）；3.3.2.4 對(duì)發(fā)病前14天售出的家畜及其產(chǎn)品進(jìn)行追蹤，并做

9、撲殺和無(wú)害化處理。3.3.3 對(duì)疫區(qū)采取的措施3.3.3.1在疫區(qū)周?chē)O(shè)置警示標(biāo)志，在出入疫區(qū)的交通路口設(shè)置動(dòng)物檢疫消毒站，執(zhí)行監(jiān)督檢查任務(wù)，對(duì)出入的車(chē)輛和有關(guān)物品進(jìn)行消毒；3.3.3.2 所有易感畜進(jìn)行緊急強(qiáng)制免疫，建立完整的免疫檔案；3.3.3.3 關(guān)閉家畜產(chǎn)品交易市場(chǎng)，禁止活畜進(jìn)出疫區(qū)及產(chǎn)品運(yùn)出疫區(qū)；3.3.3.4對(duì)交通工具、畜舍及用具、場(chǎng)地進(jìn)行徹底消毒；3.3.3.5對(duì)易感家畜進(jìn)行疫情監(jiān)測(cè)，及時(shí)掌握疫情動(dòng)態(tài);3.3.3.6 必要時(shí)，可對(duì)疫區(qū)內(nèi)所有易感動(dòng)物進(jìn)行撲殺和無(wú)害化處理。3.3.4對(duì)受威脅區(qū)采取的措施3.3.4.1 最后一次免疫超過(guò)一個(gè)月的所有易感畜，進(jìn)行一次緊急強(qiáng)化免疫；3.3.

10、4.2 加強(qiáng)疫情監(jiān)測(cè)，掌握疫情動(dòng)態(tài)。3.3.5 疫源分析與追蹤調(diào)查按照口蹄疫流行病學(xué)調(diào)查規(guī)范，對(duì)疫情進(jìn)行追蹤溯源、擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)分析（附件八）。3.3.6解除封鎖3.3.6.1封鎖解除的條件口蹄疫疫情解除的條件：疫點(diǎn)內(nèi)最后1頭病畜死亡或撲殺后連續(xù)觀察至少14天，沒(méi)有新發(fā)病例；疫區(qū)、受威脅區(qū)緊急免疫接種完成；疫點(diǎn)經(jīng)終末消毒；疫情監(jiān)測(cè)陰性。新血清型口蹄疫疫情解除的條件：疫點(diǎn)內(nèi)最后1頭病畜死亡或撲殺后連續(xù)觀察至少14天沒(méi)有新發(fā)病例；疫區(qū)、受威脅區(qū)緊急免疫接種完成；疫點(diǎn)經(jīng)終末消毒；對(duì)疫區(qū)和受威脅區(qū)的易感動(dòng)物進(jìn)行疫情監(jiān)測(cè)，結(jié)果為陰性。3.3.6.2解除封鎖的程序：動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)按照上述條件審驗(yàn)合格后，由獸醫(yī)

11、行政管理部門(mén)向原發(fā)布封鎖令的人民政府申請(qǐng)解除封鎖，由該人民政府發(fā)布解除封鎖令。必要時(shí)由上級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)組織驗(yàn)收。4 疫情監(jiān)測(cè)4.1 監(jiān)測(cè)主體：縣級(jí)以上動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)。4.2 監(jiān)測(cè)方法：臨床觀察、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。4.3 監(jiān)測(cè)對(duì)象：以牛、羊、豬為主，必要時(shí)對(duì)其他動(dòng)物監(jiān)測(cè)。4.4 監(jiān)測(cè)的范圍4.4.1 養(yǎng)殖場(chǎng)戶、散養(yǎng)畜，交易市場(chǎng)、屠宰廠（場(chǎng)）、異地調(diào)入的活畜及產(chǎn)品。4.4.2對(duì)種畜場(chǎng)、邊境、隔離場(chǎng)、近期發(fā)生疫情及疫情頻發(fā)等高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域的家畜進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。監(jiān)測(cè)方案按照當(dāng)年獸醫(yī)行政管理部門(mén)工作安排執(zhí)行。4.5疫區(qū)和受威脅區(qū)解除封鎖后的監(jiān)測(cè)臨床監(jiān)測(cè)持續(xù)一年，反芻動(dòng)物病原學(xué)檢測(cè)連續(xù)2次，每次間

12、隔1個(gè)月，必要時(shí)對(duì)重點(diǎn)區(qū)域加大監(jiān)測(cè)的強(qiáng)度。4.6在監(jiān)測(cè)過(guò)程中，對(duì)分離到的毒株進(jìn)行生物學(xué)和分子生物學(xué)特性分析與評(píng)價(jià)，密切注意病毒的變異動(dòng)態(tài)，及時(shí)向國(guó)務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門(mén)報(bào)告。4.7 各級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果及相關(guān)信息進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析，做好預(yù)警預(yù)報(bào)。4.8監(jiān)測(cè)結(jié)果處理監(jiān)測(cè)結(jié)果逐級(jí)匯總上報(bào)至國(guó)家動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)，按照有關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理。5 免疫5.1 國(guó)家對(duì)口蹄疫實(shí)行強(qiáng)制免疫，各級(jí)政府負(fù)責(zé)組織實(shí)施，當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)進(jìn)行監(jiān)督指導(dǎo)。免疫密度必須達(dá)到100%。5.2 預(yù)防免疫，按農(nóng)業(yè)部制定的免疫方案規(guī)定的程序進(jìn)行。5.3 突發(fā)疫情時(shí)的緊急免疫按本規(guī)范有關(guān)條款進(jìn)行。5.4 所用疫苗必須采用農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用

13、的產(chǎn)品，并由動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)統(tǒng)一組織、逐級(jí)供應(yīng)。5.5 所有養(yǎng)殖場(chǎng)/戶必須按科學(xué)合理的免疫程序做好免疫接種，建立完整免疫檔案（包括免疫登記表、免疫證、免疫標(biāo)識(shí)等）。5.6 各級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)定期對(duì)免疫畜群進(jìn)行免疫水平監(jiān)測(cè)，根據(jù)群體抗體水平及時(shí)加強(qiáng)免疫。6 檢疫監(jiān)督6.1 產(chǎn)地檢疫豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物在離開(kāi)飼養(yǎng)地之前，養(yǎng)殖場(chǎng)/戶必須向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)檢，接到報(bào)檢后，動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)必須及時(shí)到場(chǎng)、到戶實(shí)施檢疫。檢查合格后，收回動(dòng)物免疫證，出具檢疫合格證明；對(duì)運(yùn)載工具進(jìn)行消毒，出具消毒證明，對(duì)檢疫不合格的按照有關(guān)規(guī)定處理。6.2 屠宰檢疫動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)的檢疫人員對(duì)豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物進(jìn)行驗(yàn)

14、證查物，證物相符檢疫合格后方可入廠（場(chǎng)）屠宰。宰后檢疫合格，出具檢疫合格證明。對(duì)檢疫不合格的按照有關(guān)規(guī)定處理。6.3 種畜、非屠宰畜異地調(diào)運(yùn)檢疫國(guó)內(nèi)跨省調(diào)運(yùn)包括種畜、乳用畜、非屠宰畜時(shí)，應(yīng)當(dāng)先到調(diào)入地省級(jí)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)辦理檢疫審批手續(xù)，經(jīng)調(diào)出地按規(guī)定檢疫合格，方可調(diào)運(yùn)。起運(yùn)前兩周，進(jìn)行一次口蹄疫強(qiáng)化免疫，到達(dá)后須隔離飼養(yǎng)14天以上，由動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢疫檢驗(yàn)合格后方可進(jìn)場(chǎng)飼養(yǎng)。6.4 監(jiān)督管理6.4.1動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)流通環(huán)節(jié)的監(jiān)督檢查，嚴(yán)防疫情擴(kuò)散。豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物及產(chǎn)品憑檢疫合格證（章）和動(dòng)物標(biāo)識(shí)運(yùn)輸、銷(xiāo)售。6.4.2生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的場(chǎng)所，必須符合動(dòng)物防疫條件，取得動(dòng)

15、物防疫合格證，當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)日常監(jiān)督檢查。6.4.3 各地根據(jù)防控家畜口蹄疫的需要建立動(dòng)物防疫監(jiān)督檢查站，對(duì)家畜及產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)督檢查，對(duì)運(yùn)輸工具進(jìn)行消毒。發(fā)現(xiàn)疫情，按照動(dòng)物防疫監(jiān)督檢查站口蹄疫疫情認(rèn)定和處置辦法相關(guān)規(guī)定處置。6.4.4 由新血清型引發(fā)疫情時(shí)，加大監(jiān)管力度，嚴(yán)禁疫區(qū)所在縣及疫區(qū)周?chē)?0公里范圍內(nèi)的家畜及產(chǎn)品流動(dòng)。在與新發(fā)疫情省份接壤的路口設(shè)置動(dòng)物防疫監(jiān)督檢查站、卡實(shí)行24小時(shí)值班檢查；對(duì)來(lái)自疫區(qū)運(yùn)輸工具進(jìn)行徹底消毒，對(duì)非法運(yùn)輸?shù)募倚蠹爱a(chǎn)品進(jìn)行無(wú)害化處理。6.4.5任何單位和個(gè)人不得隨意處置及轉(zhuǎn)運(yùn)、屠宰、加工、經(jīng)營(yíng)、食用口蹄疫?。ㄋ溃┬蠹爱a(chǎn)品；未經(jīng)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)允許，不

16、得隨意采樣；不得在未經(jīng)國(guó)家確認(rèn)的實(shí)驗(yàn)室剖檢分離、鑒定、保存病毒。7 保障措施7.1各級(jí)政府應(yīng)加強(qiáng)機(jī)構(gòu)、隊(duì)伍建設(shè)，確保各項(xiàng)防治技術(shù)落實(shí)到位。7.2各級(jí)財(cái)政和發(fā)改部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，確保免疫、監(jiān)測(cè)、診斷、撲殺、無(wú)害化處理、消毒等防治技術(shù)工作經(jīng)費(fèi)落實(shí)。7.3各級(jí)獸醫(yī)行政部門(mén)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)應(yīng)按本技術(shù)規(guī)范，加強(qiáng)應(yīng)急物資儲(chǔ)備，及時(shí)培訓(xùn)和演練應(yīng)急隊(duì)伍。7.4發(fā)生口蹄疫疫情時(shí)，在封鎖、采樣、診斷、流行病學(xué)調(diào)查、無(wú)害化處理等過(guò)程中，要采取有效措施做好個(gè)人防護(hù)和消毒工作，防止人為擴(kuò)散。附件一：間接夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（I-ELISA）1 試驗(yàn)程序和原理1.1利用包被于固相（I，96孔平底ELISA專用微量板

17、）的FMDV型特異性抗體（AB，包被抗體，又稱為捕獲抗體），捕獲待檢樣品中相應(yīng)型的FMDV抗原（Ag）。再加入與捕獲抗體同一血清型，但用另一種動(dòng)物制備的抗血清（Ab，檢測(cè)抗體）。如果有相應(yīng)型的病毒抗原存在，則形成“夾心”式結(jié)合，并被隨后加入的酶結(jié)合物/顯色系統(tǒng)（*E/S）檢出。1.2由于FMDV的多型性，和可能并發(fā)臨床上難以區(qū)分的水泡性疾病，在檢測(cè)病料時(shí)必然包括幾個(gè)血清型（如O、A、亞洲-1型）；及臨床癥狀相同的某些疾病，如豬水泡?。⊿VD）。2 材料2.1 樣品的采集和處理 見(jiàn)附件四2.2 主要試劑2.2.1 抗體2.2.1.1包被抗體：兔抗FMDV-“O”、“A”、“亞洲-I”型146S血

18、清；及兔抗SVDV-160S血清。2.2.1.2檢測(cè)抗體：豚鼠抗FMDV-“O”、“A”、“亞洲-I”型146S血清；及豚鼠抗SVDV-160S血清。2.2.2 酶結(jié)合物 兔抗豚鼠Ig抗體(Ig)-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合物。2.2.3 對(duì)照抗原 滅活的FMDV-“O”“A”“亞洲-I”各型及SVDV細(xì)胞病毒液。2.2.4 底物溶液（底物/顯色劑） 3過(guò)氧化氫/3.3mmol/L鄰苯二胺(OPD)。2.2.5 終止液 1.25mol/L 硫酸。2.2.6 緩沖液2.2.6.1包被緩沖液 0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.6。2.2.6.2稀釋液A 0.01mol/L

19、PBS - 0.05(v/v)Tween-20，pH7.27.4。2.2.6.3稀釋液B 5脫脂奶粉（w/v）- 稀釋液A 。2.2.6.4洗滌緩沖液 0.002mol/L PBS - 0.01(v/v)Tween-20。2.3 主要器材設(shè)備2.3.1 固相 96孔平底聚苯乙烯ELISA專用板。2.3.2 移液器、尖頭及貯液槽 微量可調(diào)移液器一套，可調(diào)范圍0.55000L(56支)；多（4、8、12）孔道微量可調(diào)移液器（25250L）；微量可調(diào)連續(xù)加樣移液器（10100L）；與各移液器匹配的各種尖頭，及配套使用的貯液槽。2.3.3 振蕩器 與96孔微量板配套的旋轉(zhuǎn)振蕩器。2.3.4 酶標(biāo)儀,4

20、92nm波長(zhǎng)濾光片。2.3.5 洗板機(jī)或洗滌瓶,吸水紙巾。2.3.6 37恒溫溫室或溫箱。3 操作方法3.1 預(yù)備試驗(yàn) 為了確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，必須最優(yōu)化組合該ELISA，即試驗(yàn)所涉及的各種試劑，包括包被抗體、檢測(cè)抗體、酶結(jié)合物、陽(yáng)性對(duì)照抗原都要預(yù)先測(cè)定，計(jì)算出它們的最適稀釋度，既保證試驗(yàn)結(jié)果在設(shè)定的最佳數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，又不浪費(fèi)試劑。使用診斷試劑盒時(shí)，可按說(shuō)明書(shū)指定用量和用法。如試驗(yàn)結(jié)果不理想，重新滴定各種試劑后再檢測(cè)。3.2 包被固相3.2.1 FMDV各血清型及SVDV兔抗血清分別以包被緩沖液稀釋至工作濃度，然后按圖3-1所示布局加入微量板各行。每孔50L。加蓋后37振蕩2h?；蚴覝兀?02

21、5）振蕩30min，然后置濕盒中4過(guò)夜（可以保存1周左右）。3.2.2 一般情況下,牛病料鑒定“O”和“A”兩個(gè)型，某些地區(qū)的病料要加上“亞洲-I”型；豬病料要加上SVDV。 圖3-1：定型ELISA微量板包被血清布局 、對(duì)照和被檢樣品布局 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A FMDV“O”C+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5B “A”C+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5C “Asia-I”C+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5D SVDVC+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5E FMDV“O”C+ C+C

22、+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6F “A”C+ C+C+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6G “Asia-I”C+ C+C+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6H SVDVC+ C+C+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6試驗(yàn)開(kāi)始，依據(jù)當(dāng)天檢測(cè)樣品的數(shù)量包被，或取出包被好的板子；如用可拆卸微量板，則根據(jù)需要取出幾條。在試驗(yàn)臺(tái)上放置20min，再洗滌5次，扣干。3.3 加對(duì)照抗原和待檢樣品3.3.1 布局空白和各陽(yáng)性對(duì)照、待檢樣品在 ELISA 板上的分布位置如圖3-1所示。3.3.2 加樣3.3.2.1第5和第6列為空白對(duì)照（C-），每孔加50L稀釋液A。3.3.2.2

23、先將各型陽(yáng)性對(duì)照抗原分別以稀釋液A適當(dāng)稀釋，然后加入與包被抗體同型的各行孔中，C+為強(qiáng)陽(yáng)性，C+為陽(yáng)性，可以用同一對(duì)照抗原的不同稀釋度。每一對(duì)照2孔，每孔50L。3.3.2.3按待檢樣品的序號(hào)（S1、S2 .）逐個(gè)加入，每份樣品每個(gè)血清型加2孔，每孔50L。 37 振蕩1h，洗滌5次，扣干。3.4 加檢測(cè)抗體 各血清型豚鼠抗血清以稀釋液A稀釋至工作濃度，然后加入與包被抗體同型各行孔中，每孔50L。37振蕩1h。洗滌5次，扣干。3.5 加酶結(jié)合物 酶結(jié)合物以稀釋液B稀釋至工作濃度，每孔50L。 37振蕩40min。洗滌5次，扣干。3.6 加底物溶液試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，按當(dāng)天需要量從冰箱暗盒中取出OPD，

24、放在溫箱中融化并使之升溫至37。臨加樣前，按每6mL OPD加3雙氧水30L（一塊微量板用量），混勻后每孔加50L。37振蕩15min。3.7 加終止液 顯色反應(yīng)15分鐘，準(zhǔn)時(shí)加終止液1.25mol/L H2SO4。50L/孔。3.8 觀察和判讀結(jié)果終止反應(yīng)后,先用肉眼觀察全部反應(yīng)孔。如空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照孔的顯色基本正常,再用酶標(biāo)儀(492nm)判讀OD值。4 結(jié)果判定4.1 數(shù)據(jù)計(jì)算 為了便于說(shuō)明，假設(shè)表3-1所列數(shù)據(jù)為檢測(cè)結(jié)果（OD值）。 利用表3-1所列數(shù)據(jù),計(jì)算平均OD值和平均修正OD值（表3-2）4.1.1各行2孔空白對(duì)照（C-）平均OD值；4.1.2各行（各血清型）抗原對(duì)照（C+、

25、C+）平均OD值；4.1.3各待檢樣品各血清型（2孔）平均OD值；4.1.4計(jì)算出各平均修正OD值（每個(gè)(2)或(3)值同一行的(1)值。表3-1. 定型ELISA結(jié)果(OD值)C+ C+ C- S1 S2 S3A FMDV“O”1.84 1.740.56 0.460.06 0.041.62 1.540.68 0.720.10 0.08B “A”1.25 1.450.40 0.420.07 0.050.09 0.071.22 1.320.09 0.09C“Asia-I”1.32 1.120.52 0.500.04 0.080.05 0.090.12 0.060.07 0.09D SVDV1.0

26、8 1.100.22 0.240.08 0.080.09 0.100.08 0.120.28 0.34C+ C+ C- S4 S5 S6 E FMDV“O”0.94 0.840.24 0.220.06 0.061.22 1.120.09 0.100.13 0.17F “A”1.10 1.020.11 0.130.06 0.040.10 0.100.28 0.260.20 0.28G“Asia-I”0.39 0.410.29 0.210.09 0.090.10 0.090.10 0.100.35 0.33H SVDV0.88 0.780.15 0.110.05 0.050.11 0.070.09

27、 0.090.10 0.12表3-2.平均OD值/平均修正OD值 C+ C+ C- S1 S2 S3A FMDV“O”1.79/1.750.51/0.460.051.58/1.530.70/0.650.09/0.04B “A”1.35/1.290.41/0.350.060.08/0.021.27/1.210.09/0.03C “Asia-I”1.22/1.160.51/0.450.060.07/0.030.09/0.030.08/0.02D SVDV1.09/1.010.23/0.150.080.10/0.020.10/0.020.31/0.23 C+ C+ C- S4 S5 S6E FMDV

28、“O”0.89/0.830.23/0.170.061.17/1.110.10/0.040.15/0.09F “A”1.06/1.010.12/0.070.050.10/0.050.27/0.220.24/0.19G “Asia-I”0.40/0.310.25/0.160.090.10/0.010.10/0.010.34/0.25H SVDV0.83/0.780.13/0.080.050.09/0.050.09/0.040.11/0.064.2 結(jié)果判定4.2.1 試驗(yàn)不成立 如果空白對(duì)照(C-)平均OD值0.10，則試驗(yàn)不成立，本試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。4.2.2 試驗(yàn)基本成立 如果空白對(duì)照(C-)平均

29、OD值0.10，則試驗(yàn)基本成立。4.2.3 試驗(yàn)絕對(duì)成立 如果空白對(duì)照(C-)平均OD值0.10，C+ 平均修正OD值0.10，C+ 平均修正OD值1.00, 試驗(yàn)絕對(duì)成立。如表2中A、B、C、D行所列數(shù)據(jù)。4.2.3.1如果某一待檢樣品某一型的平均修正OD值0.10，則該血清型為陰性。如S1的“A”、“Asia-1”型和“SVDV”。4.2.3.2如果某一待檢樣品某一型的平均修正OD值0.10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，則該樣品為該最高平均修正OD值所在的血清型。如S1為“O”型；S3為“Asia-I”型。4.2.3.3雖然某一待檢樣品某一型的平均修正OD值0.10，但不

30、大于其他型的平均修正OD值的2倍，則該樣品只能判定為可疑。該樣品應(yīng)接種乳鼠或細(xì)胞，并盲傳數(shù)代增毒后再作檢測(cè)。如S2“A”型。4.2.4 試驗(yàn)部分成立 如果空白對(duì)照(C-)平均OD值0.10，C+ 平均修正OD值0.10，C+ 平均修正OD值1.00, 試驗(yàn)部分成立。如表2中E、F、G、H行所列數(shù)據(jù)。4.2.4.1如果某一待檢樣品某一型的平均修正OD值0.10，而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，則該樣品為該最高平均修正OD值所在的血清型。例如S4判定為“O”型。4.2.4.2如果某一待檢樣品某一型的平均修正OD值介于0.101.00之間,而且比其他型的平均修正OD值大2倍或2倍以上，

31、該樣品可以判定為該最高OD值所在血清型。例如S5判定為“A”型。4.2.4.3如果某一待檢樣品某一型的平均修正OD值介于0.101.00之間,但不比其他型的平均修正OD值大2倍，該樣品應(yīng)增毒后重檢。如S6“亞洲-I”型。注意：重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，首先考慮調(diào)整對(duì)照抗原的工作濃度。如調(diào)整后再次試驗(yàn)結(jié)果仍不合格，應(yīng)更換對(duì)照抗原或其他試劑。附件二反向間接血凝試驗(yàn)（RIHA）1 材料準(zhǔn)備1.1 96孔微型聚乙烯血凝滴定板（110度），微量振蕩器或微型混合器，0.025 mL、0.05mL稀釋用滴管、乳膠吸頭或25L、50L移液加樣器。1.2 pH7.6、0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.6、0.05mol/

32、L PB），pH7.6、50%丙三醇磷酸緩沖液（GPB），pH7.2、0.11mol/L磷酸緩沖液（pH7.2、0.11mol/L PB），配制方法見(jiàn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 19200-2003）豬水泡病診斷技術(shù)附錄A（規(guī)范性附錄）。1.3 稀釋液I、稀釋液II，配制方法見(jiàn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 19200-2003）豬水泡病診斷技術(shù)附錄B（規(guī)范性附錄）。1.4 標(biāo)準(zhǔn)抗原、陽(yáng)性血清，由指定單位提供，按說(shuō)明書(shū)使用和保存。1.5敏化紅細(xì)胞診斷液：由指定單位提供，效價(jià)滴定見(jiàn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 19200-2003）豬水泡病診斷技術(shù)附錄C（規(guī)范性附錄）。1.6 被檢材

33、料處理方法見(jiàn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 19200-2003）豬水泡病診斷技術(shù)附錄E（規(guī)范性附錄）。2 操作方法2.1 使用標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行口蹄疫A、O、C、Asia-I型及與豬水泡病鑒別診斷。2.1.1被檢樣品的稀釋：把8只試管排列于試管架上，自第1管開(kāi)始由左至右用稀釋液I作二倍連續(xù)稀釋（即1:6、1:12、1:241:768）,每管容積0.5 mL。2.1.2按下述滴加被檢樣品和對(duì)照：2.1.2.1在血凝滴定板上的第一至五排，每排的第8孔滴加第8管稀釋被檢樣品0.05 mL，每排的第7孔滴加第7管稀釋被檢樣品0.05 mL，以此類推至第1孔。2.1.2.2每排的第9 孔滴加稀釋液I 0.

34、05 mL,作為稀釋液對(duì)照。2.1.2.3每排的第10孔按順序分別滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和豬水泡病標(biāo)準(zhǔn)抗原（1：30稀釋）各0.05 mL，作為陽(yáng)性對(duì)照。2.1.3 滴加敏化紅細(xì)胞診斷液：先將敏化紅細(xì)胞診斷液搖勻，于滴定板第一至五排的第110孔分別滴加口蹄疫A、O、C、Asia-I型和豬水泡病敏化紅細(xì)胞診斷液，每孔0.025 mL，置微量振蕩器上振蕩1分鐘2分鐘,2035放置1.5小時(shí)2小時(shí)后判定結(jié)果。2.2使用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行口蹄疫O型及與豬水泡病鑒別診斷。2.2.1每份被檢樣品作四排、每孔先各加入25L稀釋液II。2.2.2每排第1孔各加被檢樣品25L，然后分別由左至右作二倍

35、連續(xù)稀釋至第7孔（豎板）或第11孔（橫板）。每排最后孔留作稀釋液對(duì)照。2.2.3滴加標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：在第一、三排每孔加入25L稀釋液II；第二排每孔加入25L稀釋至1:20的口蹄疫O型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清；第四排每孔加入25L稀釋至1:100的豬水泡病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清；置微型混合器上振蕩1分鐘2分鐘，加蓋置37作用30分鐘。2.2.4滴加敏化紅細(xì)胞診斷液：在第一和第二排每孔加入口蹄疫O型敏化紅細(xì)胞診斷液25L；第三和第四排每孔加入豬水泡病敏化紅細(xì)胞診斷液25L；置微型混合器上振蕩1分鐘2分鐘，加蓋2035放置2小時(shí)后判定結(jié)果。3 結(jié)果判定3.1按以下標(biāo)準(zhǔn)判定紅細(xì)胞凝集程度：“+”100%完全凝集，紅細(xì)胞均勻

36、的分布于孔底周?chē)弧?”75%凝集，紅細(xì)胞均勻的分布于孔底周?chē)椎字行挠屑t細(xì)胞形成的針尖大的小點(diǎn)；“+”50%凝集，孔底周?chē)胁痪鶆虻募t細(xì)胞分布，孔底有一紅細(xì)胞沉下的小點(diǎn)；“+”25%凝集，孔底周?chē)胁痪鶆虻募t細(xì)胞分布，但大部分紅細(xì)胞已沉積于孔底；“”不凝集，紅細(xì)胞完全沉積于孔底成一圓點(diǎn)。3.2操作方法2.1的結(jié)果判定：稀釋液I對(duì)照孔不凝集、標(biāo)準(zhǔn)抗原陽(yáng)性孔凝集試驗(yàn)方成立。3.2.1若只第一排孔凝集，其余四排孔不凝集，則被檢樣品為口蹄疫A型；若只第二排孔凝集，其余四排孔不凝集，則被檢樣品為口蹄疫O型；以此類推。若只第五排孔凝集，其余四排孔不凝集，則被檢樣品為豬水泡病3.2.2致紅細(xì)胞50%凝

37、集的被檢樣品最高稀釋度為其凝集效價(jià)。3.2.3如出現(xiàn)2排以上孔的凝集，以某排孔的凝集效價(jià)高于其余排孔的凝集效價(jià)2個(gè)對(duì)數(shù)（以2為底）濃度以上者即可判為陽(yáng)性，其余判為陰性。3.3操作方法2.2的結(jié)果判定：稀釋液II對(duì)照孔不凝集試驗(yàn)方可成立。3.3.3.1若第一排出現(xiàn)2孔以上的凝集（+以上），且第二排相對(duì)應(yīng)孔出現(xiàn)2個(gè)孔以上的凝集抑制，第三、四排不出現(xiàn)凝集判為口蹄疫O型陽(yáng)性。若第三排出現(xiàn)2孔以上的凝集（+以上），且第四排相對(duì)應(yīng)孔出現(xiàn)2個(gè)孔以上的凝集抑制，第一、二排不出現(xiàn)凝集則判為豬水泡病陽(yáng)性。3.3.3.2致紅細(xì)胞50%凝集的被檢樣品最高稀釋度為其凝集效價(jià)。附件三正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）1 原理 用

38、已知血凝抗原檢測(cè)未知血清抗體的試驗(yàn)，稱為正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）。 抗原與其對(duì)應(yīng)的抗體相遇，在一定條件下會(huì)形成抗原復(fù)合物，但這種復(fù)合物的分子團(tuán)很小，肉眼看不見(jiàn)。若將抗原吸附（致敏）在經(jīng)過(guò)特殊處理的紅細(xì)胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗體的反應(yīng)靈敏性。這種經(jīng)過(guò)口蹄疫純化抗原致敏的紅細(xì)胞與口蹄疫抗體相遇，紅細(xì)胞便出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。2 適用范圍 主要用于檢測(cè)O型口蹄疫免疫動(dòng)物血清抗體效價(jià)。3 試驗(yàn)器材和試劑3.1 96孔110V型醫(yī)用血凝板，與血凝板大小相同的玻板3.2 微量移液器（50L 25L）取液塑咀3.3 微量振蕩器3.4 O型口蹄疫血凝抗原3.5 O型口蹄疫陰性對(duì)照血清3.6

39、 O型口蹄疫陽(yáng)性對(duì)照血清3.7 稀釋液3.8 待檢血清（每頭約0.5ml血清即可）56水浴滅活30分鐘4 試驗(yàn)方法4.1 加稀釋液 在血凝板上1-6排的1-9孔；第7排的1-4孔第6-7孔；第8排的1-12孔各加稀釋液50L。4.2 稀釋待檢血清 取1號(hào)待檢血清50L加入第1排第1孔，并將塑咀插入孔底，右手拇指輕壓彈簧1-2次混勻（避免產(chǎn)生過(guò)多的氣泡），從該孔取出50L移入第2孔，混勻后取出50L移入第3 孔直至第9孔混勻后取出50L丟棄。此時(shí)第1排1-9孔待檢血清的稀釋度（稀釋倍數(shù)）依次為：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512。 取2號(hào)待檢

40、血清加入第2排；取3號(hào)待檢血清加入第3排均按上法稀釋，注意！每取一份血清時(shí)，必須更換塑咀一個(gè)。4.3 稀釋陰性對(duì)照血清 在血凝板的第7排第1孔加陰性血清50L，對(duì)倍稀釋至第4孔，混勻后從該孔取出50L丟棄。此時(shí)陰性血清的稀釋倍數(shù)依次為1:2、1:4、1:8、1:16。第6-7孔為稀釋液對(duì)照。4.4 稀釋陽(yáng)性對(duì)照血清 在血凝板的第8排第1孔加陽(yáng)性血清50L，對(duì)倍數(shù)稀釋至第12孔，混勻后從該孔取出50L丟棄。此時(shí)陽(yáng)性血清的稀釋倍數(shù)依次為1：2-1：4096。4.5 加血凝抗原 被檢血清各孔、陰性對(duì)照血清各孔、陽(yáng)性對(duì)照血清各孔、稀釋液對(duì)照孔均各加O型血凝抗原（充分搖勻，瓶底應(yīng)無(wú)血球沉淀）25L。4.

41、6 振蕩混勻 將血凝板置于微量振蕩器上1-2分鐘，如無(wú)振蕩器，用手輕拍混勻亦可，然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，不出現(xiàn)血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下或37下靜置1.5-2小時(shí)判定結(jié)果，也可延至翌日判定。4.7 判定標(biāo)準(zhǔn) 移去玻板，將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對(duì)照血清1:16孔，稀釋液對(duì)照孔，均應(yīng)無(wú)凝集（血球全部沉入孔底形成邊緣整齊的小圓點(diǎn)），或僅出現(xiàn)“+”凝集（血球大部沉于孔底，邊緣稍有少量血球懸?。?。 陽(yáng)性血清對(duì)照1:2-1:256各孔應(yīng)出現(xiàn)“+”“+”凝集為合格（少量血球沉入孔底，大部血球懸浮于孔內(nèi)）。在對(duì)照孔合格的前提下，再觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“+”凝集的最大稀釋倍

42、數(shù)為該份血清的抗體效價(jià)。例如1號(hào)待檢血清1-5孔呈現(xiàn)“+”“+”凝集，6-7孔呈現(xiàn)“+”凝集，第8孔呈現(xiàn)“+”凝集，第9孔無(wú)凝集，那么就可判定該份血清的口蹄疫抗體效價(jià)為1:128。接種口蹄疫疫苗的豬群免疫抗體效價(jià)達(dá)到1:128（即第7孔）牛群、羊群免疫抗體效價(jià)達(dá)到1:256（第8孔）呈現(xiàn)“+”凝集為免疫合格。5 檢測(cè)試劑的性狀、規(guī)格5.1 性狀5.1.1 液體血凝抗原：搖勻呈棕紅色（或咖啡色），靜置后，血球逐漸沉入瓶底。5.1.2 陰性對(duì)照血清：淡黃色清亮稍帶粘性的液體。5.1.3 陽(yáng)性對(duì)照血清：微紅或淡色稍混濁帶粘性的液體。5.1.4 稀釋液：淡黃或無(wú)色透明液體，低溫下放置，瓶底易析出少量結(jié)

43、晶，在水浴中加溫后即可全溶，不影響使用。5.2 包裝5.2.1 液體血凝抗原：搖勻后即可使用，5ml/瓶。5.2.2 陰性血清：1ml/瓶，直接稀釋使用。5.2.3 陽(yáng)性血清：1ml/瓶，直接稀釋使用。5.2.4 稀釋液：100 ml/瓶，直接使用，4-8保存。5.2.5 保存條件及保存期5.2.5.1 液體血凝抗原：4-8保存（切勿凍結(jié)），保存期3個(gè)月。5.2.5.2 陰性對(duì)照血清：-15-20保存，有效期1年。5.2.5.3 陽(yáng)性對(duì)照血清：-15-20保存，有效期1年。6 注意事項(xiàng)6.1 為使檢測(cè)獲得正確結(jié)果，請(qǐng)?jiān)跈z測(cè)前仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。6.2 嚴(yán)重溶血或嚴(yán)重污染的血清樣品不宜檢測(cè)，以免發(fā)生

44、非特異性反應(yīng)。6.3 勿用90和130血凝板，嚴(yán)禁使用一次性血凝板，以免誤判結(jié)果。6.4 用過(guò)的血凝板應(yīng)及時(shí)在水龍頭沖凈血球。再用蒸餾水或去離子水沖洗2次，甩干水份放37恒溫箱內(nèi)干燥備用。檢測(cè)用具應(yīng)煮沸消毒，37干燥備用。血凝板應(yīng)浸泡在洗液中（濃硫酸與重鉻酸鉀按1：1混合），48小時(shí)撈出后清水沖凈。6.5 每次檢測(cè)只做一份陰性、陽(yáng)性和稀釋液對(duì)照?！?”表示完全不凝集或0-10%血球凝集?！?”表示10-25%血球凝集 “+”表示75%血球凝集?！?”表示50%血球凝集 “+”表示90-100%血球凝集。6.6 用不同批次的血凝抗原檢測(cè)同一份血清時(shí)，應(yīng)事先用陽(yáng)性血清準(zhǔn)確測(cè)定各批次血凝抗原的效價(jià)，

45、取抗原效價(jià)相同或相近的血凝抗原檢測(cè)待檢血清抗體水平的結(jié)果是基本一致的，如果血凝抗原效價(jià)差別很大用來(lái)檢測(cè)同一血清樣品，肯定會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果不一致。6.7 收到本試劑盒時(shí)，應(yīng)立即打開(kāi)包裝，取出血凝抗原瓶，用力搖動(dòng)，使粘附在瓶蓋上的紅細(xì)胞搖下，否則易出現(xiàn)沉渣，影響使用效果。附件四口蹄疫病料的采集、保存與運(yùn)送采集、保存和運(yùn)輸樣品須符合下列要求，并填寫(xiě)樣品采集登記表。1 樣品的采集和保存1.1 組織樣品1.1.1 樣品的選擇用于病毒分離、鑒定的樣品以發(fā)病動(dòng)物(牛、羊或豬)未破裂的舌面或蹄部,鼻鏡,乳頭等部位的水泡皮和水泡液最好。對(duì)臨床健康但懷疑帶毒的動(dòng)物可在撲殺后采集淋巴結(jié)、脊髓、肌肉等組織樣品作為檢測(cè)材

46、料。1.1.2 樣品的采集和保存水泡樣品采集部位可用清水清洗，切忌使用酒精、碘酒等消毒劑消毒、擦拭。1.1.2.1 未破裂水泡中的水泡液用滅菌注射器采集至少1毫升，裝入滅菌小瓶中(可加適量抗菌素)，加蓋密封；盡快冷凍保存。1.1.2.2 剪取新鮮水泡皮35克放入滅菌小瓶中,加適量（2倍體積）50甘油/磷酸鹽緩沖液(pH7.4), 加蓋密封；盡快冷凍保存。1.1.2.3 在無(wú)法采集水泡皮和水泡液時(shí)，可采集淋巴結(jié)、脊髓、肌肉等組織樣品35克裝入潔凈的小瓶?jī)?nèi), 加蓋密封；盡快冷凍保存。每份樣品的包裝瓶上均要貼上標(biāo)簽，寫(xiě)明采樣地點(diǎn)、動(dòng)物種類、編號(hào)、時(shí)間等。1.2 牛、羊食道-咽部分泌物(O-P液)樣品

47、1.2.1 樣品采集被檢動(dòng)物在采樣前禁食(可飲水)12小時(shí)，以免反芻胃內(nèi)容物嚴(yán)重污染O-P液。采樣探杯在使用前經(jīng)0.2檸檬酸或2氫氧化鈉浸泡5分鐘，再用自來(lái)水沖洗。每采完一頭動(dòng)物,探杯要重復(fù)進(jìn)行消毒和清洗。采樣時(shí)動(dòng)物站立保定，將探杯隨吞咽動(dòng)作送入食道上部1015cm處，輕輕來(lái)回移動(dòng)23次，然后將探杯拉出。如采集的O-P液被反芻胃內(nèi)容物嚴(yán)重污染，要用生理鹽水或自來(lái)水沖洗口腔后重新采樣。1.2.2 樣品保存 將探杯采集到的810mL O-P液倒入25 mL以上的滅菌玻璃容器中, 容器中應(yīng)事先加有810mL細(xì)胞培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液（0.04mol/L 、pH7.4），加蓋密封后充分搖勻，貼上防水標(biāo)簽

48、,并寫(xiě)明樣品編號(hào)、采集地點(diǎn)、動(dòng)物種類、時(shí)間等，盡快放入裝有冰塊的冷藏箱內(nèi)，然后轉(zhuǎn)往-60冰箱凍存。通過(guò)病原檢測(cè)，做出追溯性診斷。1.3 血清 懷疑曾有疫情發(fā)生的畜群，錯(cuò)過(guò)組織樣品采集時(shí)機(jī)時(shí)，可無(wú)菌操作采集動(dòng)物血液，每頭不少于10mL。自然凝固后無(wú)菌分離血清裝入滅菌小瓶中，可加適量抗菌素，加蓋密封后冷藏保存。每瓶貼標(biāo)簽并寫(xiě)明樣品編號(hào)，采集地點(diǎn)，動(dòng)物種類，時(shí)間等。通過(guò)抗體檢測(cè)，做出追溯性診斷。1.4 采集樣品時(shí)要填寫(xiě)樣品采集登記表2 樣品運(yùn)送運(yùn)送前將封裝和貼上標(biāo)簽，已預(yù)冷或冰凍的樣品玻璃容器裝入金屬套筒中，套筒應(yīng)填充防震材料，加蓋密封，與采樣記錄一同裝入專用運(yùn)輸容器中。專用運(yùn)輸容器應(yīng)隔熱堅(jiān)固，內(nèi)裝

49、適當(dāng)冷凍劑和防震材料。外包裝上要加貼生物安全警示標(biāo)志。以最快方式，運(yùn)送到檢測(cè)單位。為了能及時(shí)準(zhǔn)確地告知檢測(cè)結(jié)果，請(qǐng)寫(xiě)明送樣單位名稱和聯(lián)系人姓名、聯(lián)系地址、郵編、電話、傳真等。送檢材料必須附有詳細(xì)說(shuō)明，包括采樣時(shí)間、地點(diǎn)、動(dòng)物種類、樣品名稱、數(shù)量、保存方式及有關(guān)疫病發(fā)生流行情況、臨床癥狀等。附件五口蹄疫撲殺技術(shù)規(guī)范1 撲殺范圍：病畜及規(guī)定撲殺的易感動(dòng)物。2 使用無(wú)出血方法撲殺：電擊、藥物注射。3 將動(dòng)物尸體用密閉車(chē)運(yùn)往處理場(chǎng)地予以銷(xiāo)毀。4 撲殺工作人員防護(hù)技術(shù)要求4.1 穿戴合適的防護(hù)衣服4.1.1 穿防護(hù)服或穿長(zhǎng)袖手術(shù)衣加防水圍裙。4.1.2 戴可消毒的橡膠手套。4.1.3 戴N95口罩或標(biāo)準(zhǔn)

50、手術(shù)用口罩。4.1.4 戴護(hù)目鏡。4.1.5 穿可消毒的膠靴，或者一次性的鞋套。4.2 洗手和消毒4.2.1 密切接觸感染牲畜的人員,用無(wú)腐蝕性消毒液浸泡手后，在用肥皂清洗2次以上。4.2.2 牲畜撲殺和運(yùn)送人員在操作完畢后，要用消毒水洗手，有條件的地方要洗澡。4.3 防護(hù)服、手套、口罩、護(hù)目鏡、膠鞋、鞋套等使用后在指定地點(diǎn)消毒或銷(xiāo)毀。附件六口蹄疫無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范所有病死牲畜、被撲殺牲畜及其產(chǎn)品、排泄物以及被污染或可能被污染的墊料、飼料和其他物品應(yīng)當(dāng)進(jìn)行無(wú)害化處理。無(wú)害化處理可以選擇深埋、焚燒等方法，飼料、糞便也可以堆積發(fā)酵或焚燒處理。1 深埋1.1 選址：掩埋地應(yīng)選擇遠(yuǎn)離學(xué)校、公共場(chǎng)所、居

51、民住宅區(qū)、動(dòng)物飼養(yǎng)和屠宰場(chǎng)所、村莊、飲用水源地、河流等。避免公共視線。1.2 深度：坑的深度應(yīng)保證動(dòng)物尸體、產(chǎn)品、飼料、污染物等被掩埋物的上層距地表1.5米以上?？拥奈恢煤皖愋蛻?yīng)有利于防洪。1.3 焚燒：掩埋前，要對(duì)需掩埋的動(dòng)物尸體、產(chǎn)品、飼料、污染物等實(shí)施焚燒處理。1.4 消毒：掩埋坑底鋪2CM厚生石灰；焚燒后的動(dòng)物尸體、產(chǎn)品、飼料、污染物等表面，以及掩埋后的地表環(huán)境應(yīng)使用有效消毒藥品噴灑消毒。1.5 填土：用土掩埋后，應(yīng)與周?chē)制?。填土不要太?shí)，以免尸腐產(chǎn)氣造成氣泡冒出和液體滲漏。1.6 掩埋后應(yīng)設(shè)立明顯標(biāo)記。2 焚化疫區(qū)附近有大型焚尸爐的，可采用焚化的方式。3 發(fā)酵飼料、糞便可在指定地點(diǎn)

52、堆積，密封發(fā)酵，表面應(yīng)進(jìn)行消毒。以上處理應(yīng)符合環(huán)保要求，所涉及到的運(yùn)輸、裝卸等環(huán)節(jié)要避免灑漏，運(yùn)輸裝卸工具要徹底消毒后清洗。附件七口蹄疫疫點(diǎn)、疫區(qū)清洗消毒技術(shù)規(guī)范1 成立清洗消毒隊(duì)清洗消毒隊(duì)?wèi)?yīng)至少配備一名專業(yè)技術(shù)人員負(fù)責(zé)技術(shù)指導(dǎo)。2 設(shè)備和必需品2.1 清洗工具：掃帚、叉子、鏟子、鍬和沖洗用水管。2.2 消毒工具：噴霧器、火焰噴射槍、消毒車(chē)輛、消毒容器等。2.3 消毒劑：醛類、氧化劑類、氯制劑類等合適的消毒劑。2.4 防護(hù)裝備：防護(hù)服、口罩、膠靴、手套、護(hù)目鏡等。3 疫點(diǎn)內(nèi)飼養(yǎng)圈舍清理、清洗和消毒3.1 對(duì)圈舍內(nèi)外消毒后再行清理和清洗。3.2 首先清理污物、糞便、飼料等。3.3 對(duì)地面和各種用

53、具等徹底沖洗，并用水洗刷圈舍、車(chē)輛等，對(duì)所產(chǎn)生的污水進(jìn)行無(wú)害化處理。3.4 對(duì)金屬設(shè)施設(shè)備，可采取火焰、熏蒸等方式消毒。3.5 對(duì)飼養(yǎng)圈舍、場(chǎng)地、車(chē)輛等采用消毒液噴灑的方式消毒。3.6 飼養(yǎng)圈舍的飼料、墊料等作深埋、發(fā)酵或焚燒處理。3.7 糞便等污物作深埋、堆積密封或焚燒處理。4 交通工具清洗消毒4.1 出入疫點(diǎn)、疫區(qū)的交通要道設(shè)立臨時(shí)性消毒點(diǎn)，對(duì)出入人員、運(yùn)輸工具及有關(guān)物品進(jìn)行消毒。4.2 疫區(qū)內(nèi)所有可能被污染的運(yùn)載工具應(yīng)嚴(yán)格消毒，車(chē)輛內(nèi)、外及所有角落和縫隙都要用消毒劑消毒后再用清水沖洗，不留死角。4.3 車(chē)輛上的物品也要做好消毒。4.4 從車(chē)輛上清理下來(lái)的垃圾和糞便要作無(wú)害化處理。5 牲畜

54、市場(chǎng)消毒清洗5.1 用消毒劑噴灑所有區(qū)域。5.2 飼料和糞便等要深埋、發(fā)酵或焚燒。6 屠宰加工、儲(chǔ)藏等場(chǎng)所的清洗消毒6.1 所有牲畜及其產(chǎn)品都要深埋或焚燒。6.2 圈舍、過(guò)道和舍外區(qū)域用消毒劑噴灑消毒后清洗。6.3 所有設(shè)備、桌子、冰箱、地板、墻壁等用消毒劑噴灑消毒后沖洗干凈。6.4 所有衣服用消毒劑浸泡后清洗干凈，其他物品都要用適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行消毒。6.5 以上所產(chǎn)生的污水要經(jīng)過(guò)處理,達(dá)到環(huán)保排放標(biāo)準(zhǔn)。7 疫點(diǎn)每天消毒1次連續(xù)1周,1周后每?jī)商煜?次.疫區(qū)內(nèi)疫點(diǎn)以外的區(qū)域每?jī)商煜?次。附件八口蹄疫流行病學(xué)調(diào)查規(guī)范1 范圍本規(guī)范規(guī)定了暴發(fā)疫情時(shí)和平時(shí)開(kāi)展的口蹄疫流行病學(xué)調(diào)查工作。本規(guī)范適用于口蹄疫暴發(fā)后的跟蹤調(diào)查和平時(shí)現(xiàn)況調(diào)查