1、基因編輯技術(shù)的概念和原理,什么是基因編輯技術(shù)？,基因編輯是指對基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上， 在這位點(diǎn)上剪斷靶標(biāo) DNA 片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變， 又修改并編輯了原有的基因組， 真正達(dá)成了“編輯基因” 。,基因編輯的研究背景,傳統(tǒng)的動(dòng)物育種方法受到種源的限制，其程需要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，經(jīng)歷漫長的培育過程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進(jìn)展。,基因編輯的研究背景,現(xiàn)代動(dòng)物分子育種中，分子標(biāo)記技術(shù)能夠定位與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，鎖定基因與性狀的對應(yīng)關(guān)系，從而快捷可靠地對動(dòng)物后代進(jìn)行篩選。但

2、是，利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助篩選，改良的程度依然受限于品種自身已有的基因。 所以，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行品種改良，可以突破種源的限制及種間雜交的瓶頸，獲取新品種，因此分子育種更為本質(zhì)和直接。,基因編輯的研究背景,目前，獲得突變體的常見方法是利用T- DNA 或轉(zhuǎn)座子構(gòu)建大規(guī)模的隨機(jī)插入突變體庫， 但是構(gòu)建覆蓋全基因組的飽和突變體庫需要的工作量大且耗費(fèi)的時(shí)間長。而通過定點(diǎn)突變的方法使目的基因完全失活，是一種最直接有效的研究特定基因功能的方法。,基因編輯的研究背景,近年來，隨著高特異性及更具操作性的人工核酸酶的出現(xiàn)和技術(shù)體系的完善，基因組編輯技術(shù)獲得了飛速發(fā)展，并將靶向基因操作推向高潮，使得定點(diǎn)基因敲除

3、、敲入變得更為簡單且高效。,基因編輯的優(yōu)勢,與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)保留了可定點(diǎn)修飾的特點(diǎn)，可應(yīng)用到更多的物種上，效率更高，構(gòu)建時(shí)間更短，成本更低。,基因編輯原理,現(xiàn)代基因組編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即借助特異性 DNA 雙鏈斷裂( DNA double-strand breaks DSBs) 激活細(xì)胞天然的修復(fù)機(jī)制，包括非同源末端連接( NHEJ)和同源重組修復(fù)(HDR) 兩條途徑。,基因編輯原理,非同源末端連接（NHEJ ）是一種低保真度的修復(fù)過程，斷裂的DNA 修復(fù)重連的過程中會(huì)發(fā)生堿基隨

4、機(jī)的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實(shí)現(xiàn)目的基因敲除。如果一個(gè)外源性供體基因序列存在，NHEJ 機(jī)制會(huì)將其連入雙鏈斷裂DSB 位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的基因敲入。,基因編輯原理,同源重組修復(fù)（HR） 是一種相對高保真度的修復(fù)過程，在一個(gè)帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會(huì)通過同源重組過程完整的整合到靶位點(diǎn)，不會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或丟失。如果在一個(gè)基因兩側(cè)同時(shí)產(chǎn)生DSB，在一個(gè)同源供體存在的情況下，可以進(jìn)行原基因的替換。,基因編輯原理,基因編輯技術(shù)的種類,目前主要有 3 種基因編輯技術(shù)， 分別為： 人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN

5、)技術(shù)； 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技術(shù)； RNA 引導(dǎo)的 CRISPR- Cas 核酸酶技術(shù)(CRISPR- Cas RGNs)。,1. ZFN 基因組編輯技術(shù),ZFN 技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能的實(shí)現(xiàn)是基于具有獨(dú)特的DNA序列識(shí)別的鋅指蛋白發(fā)展起來的。1986年Diakun 等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族的 DNA 結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2- His2鋅指模塊，到1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對由4個(gè)鋅指連接而成的ZFN

6、可識(shí)別24 bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用。,ZFN 由鋅指蛋白(ZFP)和 Fok核酸內(nèi)切酶組成。其中，由 ZFP 構(gòu)成的 DNA 識(shí)別域能識(shí)別特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由Fok構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙鏈DNA 斷裂(DSB)。于是， 細(xì)胞可以通過同源重組(HR)修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來修復(fù) DNA。HR 修復(fù)有可能會(huì)對靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而 NHEJ 修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達(dá)到基因敲除的目的。,ZFN 誘導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點(diǎn)，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但?/p>

7、目前有 3 個(gè)方面的缺陷制約了該技術(shù)的推廣:(1)以現(xiàn)有的策略設(shè)計(jì)高親和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和時(shí)間;(2)在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá) ZFN 對細(xì)胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設(shè)計(jì)具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應(yīng)。,2. TALEN 基因組編輯技術(shù),2009 年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子，它的蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有較恒定的對應(yīng)關(guān)系。隨后，TALE特異識(shí)別 DNA 序列的特性被用來取代 ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它可設(shè)計(jì)性更強(qiáng)，不受上下游序列影響，具備比ZFN 更廣闊的應(yīng)用潛力。,TALENs 包含兩個(gè)

8、 TALEN 蛋白, 每個(gè) TALEN 都是由 TALE array 與 Fok融合而成. 其中一個(gè) TALEN 靶向正義鏈上靶標(biāo)位點(diǎn), 另一個(gè)則靶向反義鏈上的靶標(biāo)位點(diǎn). 然后 Fok形成二聚體, 在靶向序列中間的 spacer 處切割 DNA, 造成雙鏈 DNA 斷裂, 隨后細(xì)胞啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 針對不同的TALEN 骨架, 其最適宜的spacer長度不同, 其長度范圍一般為1220 bp. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, TALENs在靶向DNA時(shí), 第一個(gè)堿基為 T 時(shí)其結(jié)合效果更佳。,目前， TALEN 已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、 哺乳動(dòng)物和植物的位點(diǎn)特異性基因打靶， 與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大

9、的應(yīng)用優(yōu)勢， 但仍然有些問題需要解決，例如:脫靶效應(yīng)、TALEN 與基因組進(jìn)行特異結(jié)合與染色體位置及鄰近序列有關(guān)等。,3. CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù),1987年，Ishino 等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。經(jīng)過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細(xì)菌獲得性免疫的關(guān)系。,在這個(gè)系統(tǒng)中，只憑借一段 RNA 便能識(shí)別外來基因并將其降解的功能蛋白引起了研究者的興趣。直到2012 年，Jinek 等第一次在體外系統(tǒng)中CRISPR/Cas9 為一種可編輯的短RNA 介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，標(biāo)

10、志著 CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù)成功問世。,3. CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù),CRISPR/Cas 系統(tǒng)由 Cas9 核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成. 轉(zhuǎn)錄的 sgRNA 折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與 Cas9 蛋白形成復(fù)合體, 指導(dǎo) Cas9 核酸內(nèi)切酶識(shí)別特定靶標(biāo)位點(diǎn), 在 PAM 序列上游處切割 DNA 造成雙鏈 DNA 斷裂, 并啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 從不同菌種中分離的 CRISPR/Cas 系統(tǒng), 其 CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列的長度不同, PAM 序列也可能不同。,三種不同技術(shù)的比較,續(xù)表,基因編輯新技術(shù)的用途,基因功能研究 基因治

11、療 構(gòu)建模式動(dòng)物 改造和培育新品種,1. 基因功能研究,基因敲除是在活體動(dòng)物上驗(yàn)證基因功能必不可少的邏輯環(huán)節(jié)， 但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、 ES 細(xì)胞篩選、 嵌合體動(dòng)物模型選育等一系列步驟， 成功率受到多方面因素的限制。,1. 基因功能研究,即使對于技術(shù)比較成熟的實(shí)驗(yàn)室， 利用傳統(tǒng)技術(shù)敲除大鼠或小鼠身上的某個(gè)基因一般也需要 1 年以上?；蚓庉嬓录夹g(shù)則不然， 敲除基因高效快速， 是研究基因功能的有力工具。,1. 基因功能研究,ZFN 技術(shù)已在大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥、玉米、煙草 等模式生物或經(jīng)濟(jì)物種的細(xì)胞或胚胎中以及包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluri

12、potent stem cells，iPSC)在內(nèi)的人體外培養(yǎng)細(xì)胞系中成功地實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變，其中在果蠅、 斑馬魚、大鼠等物種中還獲得了可以穩(wěn)定遺傳的突變體。,1. 基因功能研究,2009 年， 威斯康辛醫(yī)學(xué)院、 Sangamo Biosciences、 Sigma- Aldrich 等多家機(jī)構(gòu)使用 ZFN 技術(shù)，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且?guī)в性撏蛔兊拇笫笏暮蟠瑯訋в性摶蛲蛔儭?2. 基因治療,傳統(tǒng)的基因治療是將正常的基因片段引入細(xì)胞中替代有缺陷的基因， 但這種方法難以精準(zhǔn)控制， 可能產(chǎn)生很大的毒副作用?；蚓庉嬓录夹g(shù)可以精確定位， 在靶位點(diǎn)進(jìn)行修正或進(jìn)行基因切除，

13、 達(dá)到基因治療的目的。,2. 基因治療,Bacman 等人利用 TALEN 技術(shù)清除了來自于病人線粒體內(nèi)的有病 DNA。這是 TALEN 首次應(yīng)用于線粒體基因的編輯，這項(xiàng)研究有望用于治療母系遺傳的線粒體病。,2. 基因治療,Li 等人利用 ZFN 技術(shù)能在染色體上精確定位的優(yōu)勢， 通過 “剪切” 和 “粘貼” 基因， 在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了血友病治療， 避免了傳統(tǒng)基因療法帶來的插入誘變風(fēng)險(xiǎn)， 首次取得了基因組編輯在基因療法上的突破。,3. 構(gòu)建模式動(dòng)物,根據(jù)人類疾病所構(gòu)建的動(dòng)物模型，對研究這些疾病的發(fā)生及其治療有著重要意義?；虼虬屑夹g(shù)是在 ES 和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，模型構(gòu)建耗時(shí)長

14、、成本高，且模式動(dòng)物的選擇受到 ES 細(xì)胞的限制。,基因編輯新技術(shù)不受 ES 細(xì)胞的限制，效率高，速度快，且定點(diǎn)編輯更加精確，可在多種細(xì)胞及生物體的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割和修飾。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠第一人 Jaenisch 與其同事最近利用 CRISPR- Cas 系統(tǒng)又構(gòu)建了攜帶特異性突變的小鼠模型。,3. 構(gòu)建模式動(dòng)物,4. 改造和培育新品種,傳統(tǒng)的改造動(dòng)植物品種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源 DNA 片段插入受體的基因組中，改造基因功能，使其表達(dá)優(yōu)良的性狀，獲得人類需要的品種?；蚓庉嫾夹g(shù)則可以進(jìn)行定點(diǎn)修飾， 達(dá)到高效定向。,Shukla 等對玉米進(jìn)行肌醇磷酸激酶 1(inositol phosphate k

15、inase 1，IPK1)基因的修飾，使其對除草劑的耐性增強(qiáng)，在發(fā)育的種子中肌醇磷酸鹽表達(dá)譜也發(fā)生了與預(yù)期一樣的改變。 Townsend等以煙草中的丙酮醇合酶(acetolactate synthase)基因 SuR (SuRA和SuRB)位點(diǎn)為靶標(biāo)，育成了對咪唑啉酮(imidazolinone)除草劑和對磺脲(sulphonylurea)除草劑都有抵抗力的新品種。,基因編輯的不足,基因編輯是一項(xiàng)新技術(shù)， 還存在構(gòu)建復(fù)雜和價(jià)格的問題， 其脫靶效應(yīng)限制了其在基因治療等應(yīng)用上的發(fā)展。,基因編輯技術(shù)的展望,隨著越來越多物種基因組測序的完成，基因功能的研究成為后基因時(shí)代的重點(diǎn)?；蚓庉嫾夹g(shù)既可以用正?；蛱娲蛔兓蜻M(jìn)行性狀改良和基因治療，也可以用突變基因代替正?；蜻M(jìn)行基因功能的研究。,基因編輯技術(shù)的展望,與傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯技術(shù)擺脫了對 ES 細(xì)胞的限制，可以應(yīng)用于更多的物種，且定向修飾更加精確，效率更高，所需時(shí)間更短,得到的突變可以通過種系遺傳.其中，CRISPR 系統(tǒng)可以同時(shí)進(jìn)行多靶點(diǎn)的切割，易于得到純合子突變體。,基因編輯技術(shù)的