1、莼菜多糖的分離純化,PPT制作：丁楚蔚、汪心妍,匯報(bào)人：丁楚蔚,背景資料：譚曉菁、江淑華,研究背景,實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果,總結(jié)與展望,目錄,研究背景,莼菜,睡蓮科，多年生水生草本植物，又名馬蹄草， 有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、 降血脂等功效 ， 含酸性多糖、多酚、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、組胺及微量元素， 多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于葉底部、莖周?chē)酿ひ嘿|(zhì)中，是莼菜發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。,方法流程,采用堿提醇沉工藝，經(jīng)除蛋白、除色素得到莼菜多糖 (BSP),再經(jīng)DEAE纖維素DE-52柱Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對(duì)BSP進(jìn)行分級(jí)精制,采用高效凝膠過(guò)濾

2、色譜 (HPGFC)測(cè)定BSP各組分的分子量,儀器與材料,Agilent 1200 HPLC 色譜儀 AE240 分析天平 UV-2102PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) FD-1C-55 凍干機(jī) 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 超濾儀 DZG-6020 減壓干燥箱,莼菜嫩葉；無(wú)水乙醇； NaOH；鹽酸；木瓜蛋白酶；聚酰胺樹(shù)脂； DEAE 纖維素 DE-52；瓊脂糖凝膠 Sepharose CL-6B； 透析袋；蒽酮、硫酸；純化水,粗多糖的提取,莼菜粗多糖 加40倍 0. 3 mol/L NaOH 溶液，70 加熱攪拌提取 2 h，加鹽酸中和，過(guò)濾，濾液濃縮，加入無(wú)水乙醇至 67% ，4 靜置過(guò)夜，4 500 r/min

3、 離心 20 min，80% 乙醇洗滌 3 次，沉淀減壓干燥，得 83 g 莼菜粗多糖。,除去脂溶性成分 取250g莼菜噴干粉，加無(wú)水乙醇2.5 L，60 旋轉(zhuǎn)回流提取2 h，過(guò)濾，重復(fù)操作 1 次，除去脂溶性成分，濾渣烘干。,莼菜噴干粉 新鮮莼菜嫩葉，經(jīng)清水淋洗、均漿機(jī)剪切、噴霧干燥得莼菜噴干粉 。,粗多糖純化,酶解滅活脫蛋白 粗多糖用 2.5 L 純化水復(fù)溶，加入木瓜蛋白酶，63 酶解 6 h，滅活過(guò)濾除去不溶物，濾液進(jìn)行第2 次酶解滅活脫蛋白。,聚酰胺層析 濾液流經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺層析柱脫色，濾液與聚酰胺濕填料的體積之比為11，純化水洗脫，共收集洗脫液 8 L。,濾膜過(guò)濾濃縮 再用微孔濾膜

4、過(guò)濾，濾液用超濾膜超濾濃縮至800mL 后加入無(wú)水乙醇至67%，4 靜置過(guò)夜后離心，80% 乙醇洗滌 3 次，減壓干燥。,得到BSP 獲得灰白色膠狀莼菜多糖 (BSP) 22 g，收率為 8. 8% 。,BSP含有量測(cè)定,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作,BSP純度測(cè)定 精密稱(chēng)取干燥至恒重的BSP 24.72 mg 至 500mL 量瓶，純化水溶解并定容，搖勻，測(cè)定樣品吸光度為 0.521，計(jì)算可知 BSP的純度為 61. 89% 。,紫外檢測(cè) 粗多糖經(jīng)木瓜蛋白酶脫蛋白、聚酰胺脫色素等處理后，紫外全波長(zhǎng)掃描顯示在 260、280 nm 處其吸光度接近于零，表明已除去蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)。,利用蒽酮硫酸法： 以

5、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (X)，吸光度為縱坐標(biāo) (A)得曲線方程 A = 17. 294X 0. 0076 (2 = 0. 9994)。,BSP 精制,取10 g BSP，200 mL 純化水充分溶解后過(guò)DEDA 纖維素 DE-52 離子交換柱 (60 mm 950 mm)，依次用01.0mol/L NaCl 溶液梯度洗脫，分管收集洗脫液，采用 “2. 2” 項(xiàng)下方法，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，多糖濃度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。,BSP 經(jīng) DEAE 纖維素 DE-52 分離后，可得 3 個(gè)峰 (圖 1)，透析 (截留分子量 8 000 14 000)、濃縮、凍干各峰組分，得到 BSP-1、BSP-2、

6、BSP-3。,BSP 精制,對(duì) 2 個(gè)主要組分 BSP-1、BSP-3 用瓊脂糖凝膠柱 Sepharose CL-6B 進(jìn)一步的分離純化，用純化水洗脫，蒽酮-硫酸顯色法測(cè)定多糖含有量。,洗脫曲線 (圖 2) 表明，莼菜精制多糖 BSP-1、 BSP-3 組分均一，分別濃縮、凍干 。,分子量測(cè)定 色譜條件: 色譜柱 TSK gel G5000PWxl ( 10 )、 G4000PWxl ( 10 )、G3000PWxl (7) (7. 8 mm 300 mm) 串聯(lián); 保護(hù)柱 TSKPWxl Guard column; Agilent 1260 示差折光檢測(cè)器; 流動(dòng)相為純化水; 體積流量0. 4 mL/min; 進(jìn)樣量 30L; 柱 溫30 ; 檢測(cè)器溫度 35 ; 環(huán)境溫度 25 。 稱(chēng)取葡聚糖對(duì)照品、莼菜多糖各組分樣品（BSP1、BSP2、BSP3），分別用純水溶解并配制成2mg/mL的溶液，過(guò) 0. 22 m微孔濾膜，取續(xù)濾液，將圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入 GPC軟件，建立分子量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到分子量對(duì)數(shù) log MW與洗脫體積 VR的線性回歸方程 log MW = 10. 513 0. 2377V(r = 0. 996 2)，,將莼菜多糖各組分導(dǎo)入 GPC 軟件，調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出莼菜多糖各組分的Mw、M