1、纖維素酶的分離純化 及酶學(xué)性質(zhì),制藥1102 羅志強(qiáng) 孟豪軒 陳孟南,1,9/17/2020,主要內(nèi)容,2,概念,纖維素是地球上最豐富的可再生性碳源物質(zhì)，其降解是自然界碳素循環(huán)的中心環(huán)節(jié)，有效利用纖維素可有效解決能源危機(jī)，可以用于生產(chǎn)大量化工原料，如乙醇，丁醇等，采用纖維素酶進(jìn)行水解是保證無污染地將這些纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化成簡(jiǎn)單糖的關(guān)鍵。 纖維素酶的組分復(fù)雜，主要有內(nèi)切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，-葡萄糖苷酶3種。給纖維素酶的分離純化帶來了一定的困難。,3,（一）分子量：45000-76000；最適pH：pH4-5；最適溫度：40-60 。 （二）纖維素酶各組分大多為糖蛋白。 （三）纖維素酶是誘導(dǎo)酶，誘

2、導(dǎo)物為纖維二糖。,纖維素酶的性質(zhì),纖維素酶的分子結(jié)構(gòu),纖維素酶,4,纖維素酶的來源,目前研究較多的是霉菌，其中酶活力較強(qiáng)的菌種為木霉、曲霉、根霉和青霉，特別是里斯木霉、綠色木霉、康氏木霉等較為典型，是目前公認(rèn)的較好的纖維素酶生產(chǎn)菌。,5,纖維素酶的分離純化,纖維素酶的組分大多為糖蛋白，工業(yè)上用于生 產(chǎn)纖維素酶的粗酶制劑常采用硫酸銨沉淀法，酒精 沉淀法，丹寧沉淀法和離心噴霧干燥等方法。但 在纖維素酶的分析研究上個(gè)常采用一些列的蛋白 質(zhì)分離純化技術(shù)，如分級(jí)沉淀法，凝膠過濾法等。,6,沉淀法（鹽析） 鹽析沉淀法的原理： 高鹽濃度下鹽離子與酶蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分 子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼， 降低溶解度而

3、沉淀。 通常采用的中性鹽有 硫酸銨、硫酸鈉、硫酸 鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷 酸鈉等。,7,纖維素酶的分離純化多采用硫酸銨分級(jí)沉淀法，因?yàn)榱蛩徜@具有溶解度大，對(duì)溫度變化不敏感，分級(jí)效果好等特點(diǎn)。 陳紅漫等在芽孢桿菌-葡萄糖苷酶的分離純化及特性的研究中采用硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)粗酶液分離純化，結(jié)果顯示在硫酸銨飽和度區(qū)間為20%60%時(shí)，經(jīng)硫酸銨沉淀后，酶純化倍數(shù)為 1.42，回收率為 11.41%。,8,凝膠過濾, 凝膠過濾層析法是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。 層析柱中的填料是多孔凝膠填料，多是交聯(lián)的聚糖類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離，一般是大分子先流出

4、來。小分子后流出來。 具有條件溫和,簡(jiǎn)便,分離范圍廣,回收率高等特點(diǎn),9,王玢等人對(duì)海洋細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶粗酶液進(jìn)行鹽析，透析并分別過葡聚糖凝 膠 層 析 柱SephdedxG 89 ,SephdedxG50和 SephdedxG75,結(jié)果顯示SephdedxG75 分離效果最好。 賀剛等運(yùn)用葡聚糖凝膠層析柱SephdedxG75 法對(duì)草魚腸道一菌株產(chǎn)纖維素酶粗酶液進(jìn)行分離純化，結(jié)果顯示，分離純化后酶的比活力提高了 2.92 倍，回收率為5.38%,10,等電聚焦電泳法,等電聚焦電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)不同#在一個(gè)連續(xù)的，穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳的蛋白質(zhì)分離和分析技術(shù)，等電聚焦電泳具有很高

5、的分辨率，可以分離等電點(diǎn)相差 0.010.02個(gè)pH單位的蛋白質(zhì)。,11,雙水相體系萃取法,雙水相體系萃取是利用兩種聚合物或多聚物在水相中的不相溶性，形成兩相，兩相對(duì)蛋白質(zhì)分子的親和能力不同，達(dá)到從樣品溶液中直接分離純化蛋白質(zhì)的目的，也可起到濃縮蛋白質(zhì)的作用。雙水相體系萃取具有條件溫和產(chǎn)品活性損失少，處理量大，設(shè)備投資小，操作簡(jiǎn)單，易于放大及連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)，酶，核酸及多糖等生物大分子的分離純化。 舒國(guó)偉等運(yùn)用雙水相萃取技術(shù)對(duì)纖維素酶進(jìn)行萃取，結(jié)果表明，在聚乙二醇4000硫酸銨雙水相體系中，雙水相體系的質(zhì)量組成為硫酸銨8%，EG4000為26%,pH為4.8時(shí),分配系數(shù) K為

6、5.21，萃取率為 79.4%,12,除了上述方法，還有反膠束萃取法，高效液相色譜，十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法等,13,纖維素酶的應(yīng)用,14,纖維素酶的應(yīng)用,纖維素酶在食品工業(yè)應(yīng)用極為廣泛。 如將纖維素酶應(yīng)用于豆腐生產(chǎn)工藝中，結(jié)果表明，在大豆浸漬時(shí)添加0.5%5.0%纖維素酶，可提高4.00%11.01%豆腐品率，且所產(chǎn)豆腐色質(zhì)和風(fēng)味無明顯變化，同時(shí)不改變?cè)猩a(chǎn)工藝路線，其經(jīng)濟(jì)效益比較明顯 。,15,纖維素酶用作飼料添加劑,能明顯提高飼料消化率和利用率,促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。在奶牛的養(yǎng)殖上,纖維素酶能增強(qiáng)奶牛食欲,增加其對(duì)粗飼料的采食量,提高飼料的消化率和利用率,提高產(chǎn)奶量,同時(shí),還能降低奶

7、牛消化道的發(fā)病率。,纖維素酶的應(yīng)用,16,纖維素酶的應(yīng)用,天然纖維如棉、麻等紡織品具有較強(qiáng)的吸濕、透氣性，備受消毒者青睞。但棉、麻及其混紡布料上存在細(xì)毛，與皮膚接觸時(shí)會(huì)產(chǎn)生刺癢感，因此近幾年來，利用纖維素酶進(jìn)行生物整理越來越受到紡織界的重視。利用纖維素酶進(jìn)行酶處理，能使麻、棉表面剝離和縱向復(fù)合細(xì)胞間層侵蝕，使纖維梢絲束化或脫落，能極大地降低對(duì)皮膚的刺癢，提高棉麻織物的服用性能及產(chǎn)品檔次。,17,纖維素酶的應(yīng)用,纖維素酶在造紙、草藥提取等方面均有很大應(yīng)用潛力。用纖維素酶適當(dāng)處理紙漿，能增加微細(xì)纖維生成量和提高保水度，有可能促進(jìn)某些紙張抗張力提高。,18,纖維素酶的問題與展望,1.纖維素酶作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究，由于纖維素酶的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，加之纖維素酶不易分離純化、結(jié)晶難，應(yīng)進(jìn)一步在分離純化技術(shù)和研究方法上進(jìn)行突破。 2.目