1、真核細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選標記及原理,小組：周四班二組 組員：薛瑩超（報告者） 滕達 曾欣宜 席杰 賴惠英 鄧宇星,外源基因表達的三個概念,轉(zhuǎn)染 通過生化或者物理方法將目的基因?qū)胝婧思毎?。,分類,轉(zhuǎn)導 通過病毒介導，用基因組中攜帶有克隆目的片斷的病毒來感染靶細胞。,轉(zhuǎn)化 通過生化或者物理方法將目的基因?qū)朐思毎?。,常用的真核表達系統(tǒng),酵母表達系統(tǒng) 絲狀真菌表達系統(tǒng) 昆蟲表達系統(tǒng) 哺乳動物表達系統(tǒng),轉(zhuǎn) 染 方 法,理想的細胞轉(zhuǎn)染方法，應該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小等特點。病毒介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高、細胞毒性很低，但準備程序復雜，對細胞類型有很強的選擇性很難普及。非病毒介導的轉(zhuǎn)染

2、技術(shù)中，以陽離子非脂性物質(zhì)為主的混合物配方轉(zhuǎn)染效率最高。該類轉(zhuǎn)染具有廣譜、細胞毒性小、性能穩(wěn)定等特點，且不受培養(yǎng)液中的血清和抗生素的干擾，比脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法更方便。,轉(zhuǎn)染后的表達,1.瞬時表達 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中，一部分轉(zhuǎn)運進入細胞核，進行轉(zhuǎn)錄輸出mRNA進行蛋白質(zhì)合成。幾天內(nèi)大部分的質(zhì)粒都會被降解或傳代而稀釋。一周以后幾乎檢測不到。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不整合到染色體上，出現(xiàn)短暫的（24-96h）高水平表達，依賴于質(zhì)粒純度、濃 度和轉(zhuǎn)染效率。,2.穩(wěn)定表達,轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA整合到染色體上可以持續(xù)存在，轉(zhuǎn)染的細胞可以長期表達。 整合的概率比較小，要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株需要篩選標記共同轉(zhuǎn)染，通過選擇壓力維

3、持表達穩(wěn)定。需要長時間的抗性選擇培養(yǎng)。,酵母表達系統(tǒng)常用的選擇性標記,營養(yǎng)缺陷性酵母 trp1-，ura3-，his3-，leu2-， lys2-。 顯性選擇標記，用于野生型酵母菌的轉(zhuǎn)染。G418篩選。,哺乳動物細胞遺傳性標記,胸苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng) 二氫葉酸還原酶基因（dhfr）選擇系統(tǒng) 黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因（HGPRT）選擇系統(tǒng) 新霉素抗性基因（neo）選擇系統(tǒng) 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）選擇系統(tǒng) 潮霉素抗性選擇系統(tǒng),細胞內(nèi)DNA的合成途徑,細胞的DNA合成有主要途徑和旁路途徑兩種方式 1.主要途徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸脲甘酸在二氫葉酸還原酶的催化下合成DNA 2.旁路途徑

4、則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化下補救合成DNA。,胸苷激酶基因選擇系統(tǒng),遺傳標記：TK 編碼產(chǎn)物：胸苷激酶 篩選藥物：HAT選擇法 H：次黃嘌呤；補救合成核苷酸的原料 A：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成 T：胸苷；補救合成dTTP的原料 作用機理：TK是核苷酸補救合成途徑的一個關(guān)鍵酶,二氫葉酸還原酶（DHFR）基因選擇系統(tǒng),遺傳標記：DHFR：真核細胞生物合成核苷酸的關(guān)鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸 編碼產(chǎn)物：二氫葉酸還原酶（DHFR） 篩選藥物：葉酸類似物氨基喋呤或氨甲喋呤 作用機理：dhfr缺陷型細胞因不能合成核酸而死亡

5、，而導入了外源基因的細胞成功存活，并且在氨甲喋呤的選擇壓力下大量表達蛋白。,黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因選擇系統(tǒng),遺傳標記：XGPRT 編碼產(chǎn)物：黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 篩選藥物：霉酚酸 作用機理：XGPRT合成GMP。 哺乳動物細胞無XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤磷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（IMP）。哺乳動物細胞可通過IMP生成GMP。當用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細胞失去合成DNA能力而死亡。 將含XGPRT基因的重組體導入真核細胞后，能表達XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中

6、通過XMP中間體補救合成GMP，使DNA合成正常進行。加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而陰性細胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此來篩選陽性細胞。,新霉素抗性基因選擇系統(tǒng),遺傳標記：APH 編碼產(chǎn)物：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 篩選藥物：新霉素，即G418一種氨基糖苷類抗生素，影響80S核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成 作用機理：新霉素抗性基因編碼3磷酸轉(zhuǎn)移酶降解G418。適用于所有的真核細胞,氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因選擇系統(tǒng),遺傳標記：CAT，大腸桿菌Tn9轉(zhuǎn)座子編碼的催化氯霉素 乙酰化反應的蛋白質(zhì) 編碼產(chǎn)物：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 篩選藥物：氯霉素 作用機理：真核細胞缺乏CAT，將CAT作為報告基因與目的基因一起導入到真核細胞，可在加入氯霉