1、課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),臨澧一中生物組匡昭澤,一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕浮?3、常見的分解尿素的微生物,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。,4、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌,二.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,.設(shè)置對(duì)照,實(shí)例：,啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去

2、尋找。,原因：因?yàn)闊崛獪囟?0800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。,DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,.篩選菌株,土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,計(jì)數(shù)法,直接計(jì)數(shù)法 平板計(jì)數(shù)法 比濁法 膜過濾法,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：,1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,不能區(qū)分死菌與活菌； 不

3、適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。,缺點(diǎn)：,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：,2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法） 原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,注意事項(xiàng)： 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。 為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計(jì)的

4、菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只有一個(gè)菌落。 設(shè)置重復(fù)組。同一稀釋度下至少涂布3個(gè)平板作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。分析結(jié)果時(shí)，需考慮重復(fù)組的結(jié)果是否相近，若結(jié)果相差太遠(yuǎn)，則意味著操作者有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。,設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,.設(shè)置對(duì)照：,實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。分析其原因。,原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含

5、氮物質(zhì)),究竟是哪個(gè)原因？設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來證明。,小結(jié)： 通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn),方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測(cè)： 如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,二.實(shí)驗(yàn)的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。 .制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。,

6、應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板,三樣品的稀釋,為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？,原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。 結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條

7、件。,.取樣涂布,實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。,實(shí)驗(yàn)流程：,土壤取樣 制備培養(yǎng)基微生物的培養(yǎng)與觀察 細(xì)菌的計(jì)數(shù),（1）土壤取樣,選擇濕潤、近中性的土壤。先鏟去表層土3cm左右，再取樣。將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。,（2）制備培養(yǎng)基,制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可作為對(duì)照，判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。將菌液稀釋103107倍。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇

8、培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。,（3）微生物的培養(yǎng)與觀察,將10 g土樣加入盛有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為250 mL），充分搖勻，吸取上清液1 mL，轉(zhuǎn)移至盛有9 mL的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度。 按照由107103稀釋度的順序分別吸取0.1 mL進(jìn)行平板涂布操作。將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 溫度下培養(yǎng)。 每隔24h比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。 挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生顏色反應(yīng)。,（4）細(xì)菌的計(jì)數(shù),當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，

9、至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,微生物的培養(yǎng)與觀察,三、操作提示,無菌操作,做好標(biāo)記,規(guī)劃時(shí)間,四.結(jié)果分析與評(píng)價(jià),內(nèi)容,結(jié)論分析,是否有雜菌污染,選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落,樣品的稀釋操作,重復(fù)組的結(jié)果,對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中無菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染；

10、實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)皿中菌落數(shù)偏高，說明被雜菌污染；菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，說明培養(yǎng)物中混入其他氮源。,牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功,如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。,五.課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。,測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。,大腸桿菌

11、呈深紫色 ,有金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征,探究尖尖角,現(xiàn)有脲酶及相關(guān)實(shí)驗(yàn)器材，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案驗(yàn)證脲酶能催化尿素的分解。,驗(yàn)證脲酶能催化尿素的分解,實(shí)驗(yàn)題目：,尿素能被脲酶催化分解，使氨增多、pH升高，加入酚紅指示劑，指示劑表紅。,假設(shè)：,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)后，實(shí)驗(yàn)組溶液pH增大，加酚紅指示劑表紅，而對(duì)照組pH不變，加酚紅指示劑不變紅。,預(yù) 期：,取兩支潔凈的試管，標(biāo)記為A、B，向兩支試管中分別加入相同濃度的尿素溶液5mL。,實(shí)驗(yàn)步驟：,向A試管中加入脲酶溶液1mL，向B試管中蒸餾水1mL，兩支試管約在25下水浴。,過一段時(shí)間后，向A、B兩支試管中各加酚紅指示劑5滴，觀察、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并得出結(jié)論。,1.對(duì)細(xì)菌群體生長規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.至少接種一種細(xì)菌 C.接種一個(gè)細(xì)菌 D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,實(shí)踐訓(xùn)練,A,C,D,4.下列說法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平